简介：摘要目的构建人巨细胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)转录的长链非编码RNA4.9(long non-coding RNA4.9, lncRNA4.9)干扰慢病毒载体。方法设计并合成3条以lncRNA4.9为靶点的干扰序列，构建穿梭质粒GV248和目的干扰序列的重组质粒，测序验证序列，将重组质粒与骨架质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞，收集病毒颗粒并检测拷贝数。将干扰慢病毒载体转染THP-1细胞，观察荧光表达量，通过real-time RT-PCR法检测干扰效率。结果构建的3组慢病毒干扰载体(LV1、LV2、LV3)，LV2和LV3具有干扰效率，LV2组干扰效率最高。结论成功构建lncRNA4.9干扰慢病毒载体，为后续进一步研究lncRNA4.9的功能奠定了基础。

简介：摘要目的构建大鼠RNAi-腺苷A2a受体(A2aR)慢病毒载体并进行鉴定。方法首先构建3对短发夹RNA(shRNA)-A2aR序列(shRNA-A2aR 1、shRNA-A2aR 2、shRNA-A2aR 3)，在shRNA慢病毒载体中分别插入3对双链shRNA oligo，shRNA慢病毒重组质粒构建成功后，将重组质粒、包装载体、穿梭载体共转染293T细胞，从而获得病毒液。实验Ⅰ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为3组(n＝6)：空载组(V组)、shRNA-A2aR 1组和shRNA-A2aR 3组，各组分别转染MOI为10的相应病毒液，转染48 h时，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率，以筛选最佳慢病毒载体。实验Ⅱ　采用随机数字表法将大鼠原代心肌细胞分为5组(n＝36)：空载组(V组)、MOI5组、MOI10组、MOI15组和MOI20组，各组分别转染相应MOI的病毒液(最佳慢病毒载体)，于转染24、48和72 h时，采用CCK-8法测定细胞存活率，荧光显微镜下观察细胞活力和细胞死亡情况，Western blot法检测A2aR表达水平，确定干扰效率。结果实验Ⅰ　成功构建了2种shRNA-A2aR慢病毒载体(shRNA-A2aR 1、3)。shRNA-A2aR 3病毒液滴度为3.5×108 TU/ml。与V组和shRNA-A2aR 1组比较，shRNA-A2aR 3组心肌细胞A2aR表达下调(P<0.01)，shRNA-A2aR 3慢病毒载体干扰效率73%。实验Ⅱ　选择shRNA-A2aR 3慢病毒载体转染24 h时，各组细胞存活率均>85%；转染48 h时，MOI5组和MOI10组细胞存活率>80%；转染72 h各组细胞存活率<70%。倒置荧光显微镜下可见，MOI5组荧光密度稍低，MOI10组转染48 h及MOI20组转染24 h时，荧光密度较高且细胞状态较好；转染72 h时各组心肌细胞活力明显下降、死亡细胞增加。Western blot显示：MOI10组转染48 h、MOI15组转染48 h、MOI20组转染24和48 h时干扰效率均>70%。结论成功构建了大鼠shRNA-A2aR慢病毒载体，且MOI为10、转染48 h或MOI为20、转染24 h为最佳转染方案。

简介：摘要目的通过构建过表达IL-35的慢病毒载体，转染鼻咽癌细胞，建立稳定表达IL-35的鼻咽癌细胞株，为进一步研究IL-35对鼻咽癌细胞的影响奠定基础。方法根据GenBank中的EBI3和IL-l2p35基因序列，设计引物克隆EBI3和IL-l2p35基因。PCR产物和pLVX-IRES-ZsGreenl质粒（命名为H145）经过经酶切、转化、筛选、测序鉴定等后获得重组质粒pLVX-mIL-35-IRES-ZsGreenl，命名为H11864。将重组质粒H11864和H145经过慢病毒包装后转染HEK-293T细胞，收取病毒浓缩液并检测其滴度。用病毒浓缩液感染CNE细胞，用Real-time PCR和ELISA检测IL-35的表达情况。检测IL-35过表达对鼻咽癌细胞增殖能力的影响。结果测序结果显示，本研究成功构建重组质粒pLVX-mIL-35-IRES-ZsGreenl。pCDH-GFP组及pCDH-IL-35-GFP组的慢病毒滴度分别为5.10×108 TU·ml-1和1.03×109 TU·ml-1。Real-time PCR检测结果显示，与CNE-H11864（4 626 159.23±246 221.40）相比，CNE-H145（1.22±0.77）和CNE（0.80±0.65）中IL-35的mRNA表达量显著较低（均P<0.01）。ELISA检测显示，CNE-H11864中IL-35的蛋白含量为344.84 pg/ml，与CNE-H145的33.00 pg/ml相比，显著增高（P<0.01）。CCK-8检测结果表明，与空白组和质粒对照组相比，CNE-H11864组在转染72 h后吸光度值明显升高（均P<0.05），并且在96 h进一步升高（均P<0.01）。结论本研究成功构建稳定表达IL-35的鼻咽癌细胞株，IL-35蛋白能够促进人鼻咽癌细胞的增殖能力。

简介：摘要重组病毒载体疫苗的原理是将外源基因插入病毒基因组以构建重组病毒，免疫机体后在体内表达相应蛋白并诱导特异性免疫应答。该类疫苗具有载体种类多、插入片段长、能同时诱导体液免疫和细胞免疫等优势，能克服灭活疫苗的效力维持时间短和减毒活疫苗回复突变的弊端。此文综述了重组病毒载体疫苗的最新研究进展，为将来的研究提供参考。

简介：摘要目的构建DEK基因的RNA干扰（RNAi）慢病毒表达载体，并探讨其对肝癌细胞生物学行为的影响。方法采用RNAi技术，根据DEK基因的干扰序列，合成Oligo DNA,退火形成双链DNA，将其克隆到酶切后的小干扰RNA表达载体pLKO.1上，构建重组慢病毒载体pLKO.1-sh hDEK，经293T细胞包装，收集病毒上清液，感染细胞。采用实时逆转录PCR（RT-PCR）和免疫蛋白印迹法（Western blot）检测人肝癌细胞Bel-7402、Huh-7、SMMC-7721和HepG2中DEK的表达及感染慢病毒的各组细胞中DEK的敲低效率。分别通过细胞计数试剂盒-8（CCK8）增殖实验、流式细胞术、划痕实验检测细胞增殖能力、克隆形成能力、凋亡及迁移能力。两组间均数比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。结果酶切鉴定和DNA测序结果证实，重组慢病毒载体pLKO.1-sh hDEK1及pLKO.1-sh hDEK3构建成功。RT-PCR和Western blot结果显示，肝癌细胞Bel-7402和Huh7中DEK的表达较高，pLKO.1-sh hDEK3能更有效地抑制DEK基因的表达（P < 0.05），因此选择pLKO.1-sh hDEK3重组慢病毒感染肝癌细胞Bel-7402和Huh7进行后续的功能实验。CCK8细胞增殖实验结果显示肝癌细胞Bel-7402和Huh7感染重组慢病毒后，细胞增殖能力与空白对照及阴性对照相比减弱（P < 0.05）；细胞凋亡结果显示敲低组细胞凋亡率高于空白对照及阴性对照组（P < 0.05）；细胞划痕实验结果显示敲低组划痕愈合率低于空白对照及阴性对照组（P < 0.05），差异均有统计学意义；而空白对照及阴性对照组比较，差异无统计学意义。结论靶向沉默肝癌细胞中DEK的表达，能够抑制细胞增殖及迁移能力，并诱导凋亡，为进一步研究DEK基因在肝癌中的作用奠定基础。

简介：摘要目的探讨聚凝胺对小鼠骨髓源树突状细胞(BMDCs)的毒性作用以及聚凝胺促慢病毒载体转染BMDCs的最佳浓度。方法制备BMDCs悬液，随机分为实验组和对照组。实验组用不同浓度的聚凝胺处理，对照组中加入等量磷酸盐缓冲液(PBS)，采用细胞计数试剂盒(CCK-8)法和膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙锭(PI)双标记法评价聚凝胺对BMDCs的毒性作用。向BMDCs悬液中加入慢病毒载体[感染复数(MOI)＝10]，实验组用不同浓度的聚凝胺处理，对照组加入等量PBS，每天采用荧光显微镜动态观察各组绿色荧光蛋白(GFP)表达。刺激BMDCs成熟后，采用流式细胞术定量检测GFP表达。各组之间两两比较采用独立样本t检验。结果聚凝胺浓度≥11 mg/L时，活细胞数目显著减少[吸光度(A)值(0.881±0.007)比(1.031±0.017)，t＝7.832，P<0.05]，差异有统计学意义。安全浓度范围内，使用聚凝胺能显著提高GFP表达，聚凝胺浓度为8 mg/L时，GFP表达最高。结论聚凝胺对BMDCs存在剂量依赖的毒性作用，安全浓度范围内，聚凝胺可明显提高慢病毒载体对BMDCs的转染率，最适浓度为8 mg/L。

简介：摘要目的研究仙台病毒(Sendai virus，SeV)预存免疫对基于仙台病毒载体开发的Ⅱ型单纯疱疹病毒(herpes simplex virus 2，HSV-2)疫苗SeV-dF/HSV-2 ICP27和SeV-dF/HSV-2 gD免疫效果的影响，为克服预存免疫的影响提供数据参考。方法使用不同剂量(3lg、4lg、5lg、6lg、7lg、8lg CIU)仙台病毒免疫小鼠，建立不同程度预存免疫模型。对建立了预存免疫的小鼠分别免疫SeV-dF/HSV-2 ICP27和SeV-dF/HSV-2 gD，采用酶联免疫斑点检测(ELISPOT)法测定小鼠脾淋巴细胞分泌的ICP27特异性IFN-γ活性，蚀斑减少中和试验(PRNT50)测定小鼠血清中HSV-2中和抗体效价。结果小鼠经不同剂量仙台病毒免疫后建立了预存免疫，且仙台病毒中和抗体效价随着免疫剂量的增加而升高，呈现剂量依赖效应。3lg～8lg CIU仙台病毒免疫小鼠所建立的预存免疫均可对SeV-dF/HSV-2 ICP27诱导的细胞免疫产生显著抑制作用，但对SeV-dF/HSV-2 gD诱导的体液免疫未产生显著抑制作用。结论预存免疫对基于仙台病毒载体开发的疫苗的影响需要考虑预存病毒中和抗体是否存在，同时病毒载体表达何种外源蛋白也是需要考虑的因素之一。

简介：摘要随着分子生物学技术的进步和基因遗传学的发展，病毒载体系统不断地得到改良及优化，并以其特有的优势逐渐成为眼科基因治疗的良好载体之一。目前，多种病毒载体已应用于眼科疾病的基因治疗研究并取得较好成果。腺病毒载体具有瞬时表达的特点，在减轻角膜移植免疫反应等领域发挥重要作用；慢病毒载体具有稳定高效的特点，在体内可长期缓慢表达，为青光眼治疗提供了新的给药方案；腺相关病毒载体具有免疫原性低，精准持久等特点，可感染多种视网膜细胞，其与成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9联合使用，为眼科遗传疾病的精准治疗提供了新的思路。病毒载体的出现大大提高了基因治疗的应用潜力，具有传统疗法不可比拟的优势。相信随着技术的进步，以病毒为载体的基因转导技术将会很快进入临床应用，解决更多的眼科疑难问题。

简介：

简介：摘要腺相关病毒载体（AAV）是目前最重要的病毒工具，已在基因治疗领域得到广泛应用；因其具有体积小、无包膜、无致病性等特点，故而是治疗遗传性视网膜疾病的主要手段之一。目前针对原癌基因酪氨酸激酶基因治疗视网膜色素变性、ND4基因治疗Leber遗传性视神经病变以及Rab伴随蛋白-1基因治疗无脉络膜症的临床试验均发现约一半的患者视力改善。针对AAV基因治疗Leber先天性黑矇、X连锁视网膜劈裂症、全色盲以及老年性黄斑变性的临床试验也正在开展。而关于Stargardt病、Usher综合征、真性小眼球的AAV基因治疗尚在动物实验或理论阶段。目前AAV基因治疗主要用于隐性遗传性视网膜疾病，对于显性遗传性视网膜疾病需采用成簇规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9技术等来干预。对于遗传性视网膜疾病的治疗，这将是一个重要且复杂的系统性工程，需投入更多人力物力共同参与和研究，期待在不久的将来能有大的突破。

简介：摘要昆虫杆状病毒表达载体系统是基于昆虫杆状病毒及其宿主细胞建立的真核表达体系，具有安全性高、重组蛋白表达水平高、能同时表达多个基因，可对重组蛋白进行正确折叠和翻译后修饰等优势，主要应用于预防性及治疗性疫苗和基因治疗药物的研发及生产。本文对该载体系统的关键技术及应用进展作一综述。

简介：摘要：目的： 分析 恩替卡韦治疗慢性乙型病毒性肝炎慢加急性肝衰竭的价值 。 方法： 随机选择我院 2019 年 6 月至 2020 年 5 月接诊的慢性乙型病毒性肝炎慢加急性肝衰竭患者 80 例为临床观察对象，对照组患者在接受治疗的过程中主要使用拉米夫定，观察组患者在接受治疗的过程中主要使用恩替卡韦。对比两组患者接受治疗后的临床疗效、发生并发症的情况以及肝功能相关指标情况。 结果： 从本次研究结果来看，相比于对照组患者来说，观察组患者在接受治疗后临床治疗有效率以及肝功能更趋近于正常，并发症的发生概率相对更低。 结论： 临床上在针对慢性乙型病毒性肝炎慢加急性肝衰竭患者患者进行治疗的过程中， 恩替卡韦 药物能够有效提升患者的治疗有效率、改善患者的肝功能，与此同时，也能有效降低患者并发症问题的发生概率。

简介：【摘要】 目的 分析在慢性异性病毒性肝炎慢加急性肝衰竭治疗中使用恩替卡韦的临床疗效。方法 收集2019 年2 月至2020 年2 月我院收治的60 例慢性乙型病毒性肝炎慢加急性肝衰竭患者作为研究对象，30 例患者使用拉夫米定进行治疗，作为对照组，30 例患者使用恩替卡韦进行治疗，作为观察组，比较两组患者治疗前后肝功能、实验室检查指标和治疗效果。结果 治疗后观察组ALT、AST和TBil水平均明显优于对照组，P

简介：摘要目的建立乙型肝炎病毒相关慢加急性（亚急性）肝衰竭（HBV-ACLF）短期预后预测模型，并探讨该模型对HBV-ACLF患者短期预后的预测价值。方法回顾性分析2015年5月至2018年10月在天津市第二人民医院和首都医科大学附属北京佑安医院住院的HBV-ACLF患者临床资料。收集患者性别、年龄和入院时的实验室检查指标、终末期肝病模型（MELD）评分及临床并发症发生情况。根据患者入院后12周内的疾病转归情况分为生存组和死亡组，通过单因素、二元Logistic回归等方法分析影响HBV-ACLF患者短期预后的危险因素，建立预测模型，并用受试者工作特征曲线（ROC）分析各指标及预测模型对HBV-ACLF患者转归预测的准确性。结果共入选148例HBV-ACLF患者，12周生存91例，死亡57例。死亡组年龄、总胆红素（TBIL）、中性粒细胞百分比（NEUT%）、乙型肝炎表面抗原（HBsAg）、MELD评分高于生存组〔年龄（岁）：50.00（44.50，55.00）比43.00（34.00，53.00），TBIL（μmol/L）：310.30（240.70，405.70）比266.40（184.20，360.20），NEUT%：（74.52±13.05）%比（66.64±12.35）%，lg HBsAg（kU/L）：3.72（3.29，3.92）比2.97（2.49，3.78），MELD评分（分）：24.27（19.71，27.40）比21.88（18.83，24.38），均P<0.05〕，白蛋白（ALB）、总胆固醇（CHO）、凝血酶原活动度（PTA）、甲胎蛋白（AFP）低于生存组〔ALB（g/L）：29.80（27.05，31.05）比30.80（28.00，33.90），CHO（mmol/L）：1.98（1.50，2.38）比2.49（2.05，3.01），PTA：（30.37±7.09）%比（32.94±6.03）%，AFP（μg/L）：21.54（9.28，51.54）比66.16（24.50，152.80），均P<0.05〕。Logistic回归分析显示，NEUT%、HBsAg和AFP是影响HBV-ACLF患者短期预后的独立危险因素〔优势比（OR）分别为77.843、1.439、0.995，均P<0.05〕。根据回归分析结果，建立NEUT%+HBsAg+AFP三者联合的HBV-ACLF短期预后模型（NHA-ACLF模型），其公式为logit（NHA-ACLF）＝-5.441+5.688×NEUT%+0.430×lg HBsAg-0.005×AFP，该模型预测HBV-ACLF患者短期预后的ROC曲线下面积（AUC）为0.790，优于单独使用NEUT%（AUC＝0.696）、lg HBsAg（AUC＝0.670）、AFP（AUC＝0.703）及MELD评分（AUC＝0.640）的预测价值。当NHA-ACLF模型评分最佳截断值为0.459时，敏感度为73.7%，特异度为79.1%。结论NEUT%、HBsAg和AFP可作为HBV-ACLF患者短期预后的独立预测因素；与MELD评分相比，NHA-ACLF模型对HBV-ACLF患者短期预后的预测价值更高。

简介：摘要目的探讨降低角化不良蛋白基因(DKC1基因)表达对人宫颈癌HeLa细胞放射敏感性的影响。方法以慢病毒为载体通过shRNA技术建立DKC1基因低表达的细胞模型，并利用RT-PCR、Western blot验证干扰效率。将细胞分为干扰组、空白对照组和阴性对照组，通过端粒重复序列扩增酶联免疫吸附试验(TRAP-ELISA法)检测端粒酶活性，实时PCR检测相对端粒长度，克隆形成实验计算克隆形成率，并利用单击多靶模型拟合细胞存活曲线、计算放射生物学相关参数(D0、Dq、N、SF2)及放射增敏比(SER)。结果以慢病毒为载体的DKC1干扰序列(Lv-shDKC1)转染HeLa细胞后，与空白对照组相比，干扰组DKC1 mRNA及蛋白表达水平均明显下降，其表达抑制率分别为(71.330±4.112)%(t＝25.53，P<0.05)、(35.520±3.804)%(t＝4.833，P<0.05)。与空白对照组及阴性对照组相比，干扰组端粒酶活性从0.900±0.044、0.897±0.031降到0.713±0.021(F＝31.44，P<0.05)，相对端粒长度从4.233±0.306、4.633±0.379降到2.667±0.404(F＝39.15，P<0.05)，而空白对照组及阴性对照组间端粒酶活性和相对端粒长度差异均无统计学意义(P>0.05)。干扰组存活分数(SF2)(0.571±0.006)明显低于空白对照组(0.861±0.009)及阴性对照组(0.807±0.002)(F＝1 812，P<0.05)，SER为1.508。结论干扰DKC1的表达对人宫颈癌HeLa细胞有放射增敏作用，可通过抑制端粒酶活性、缩短相对端粒长度而发挥放射增敏作用，有望成为新的放射增敏靶点。

简介：【摘要】：目的 观察分析异甘草酸镁联合血浆置换治疗乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者的临床效果。方法 选取我院2017年1月-2019年12月收治的80例HBV-ACLF患者为研究对象，随机将其分为研究组和对照组，每组各有40例患者。对照组患者采用内科治疗及血浆置换治疗，研究组患者在对照组治疗的基础上接受异甘草酸镁治疗。比较两组患者治疗期间的病死率、血浆置换治疗次数，检测并比较治疗前后肝功能指标水平变化。结果 与治疗前比较，两组治疗后ALT、TBIL水平均明显降低，ALB水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。研究组治疗后ALT、TBIL水平降低显著，ALB水平升高显著，差异有统计学意义（P＜0.05）。治疗期间，研究组死亡率及血浆置换次数明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 异甘草酸镁联合血浆置换治疗能够显著改善HBV-ACLF患者的肝脏功能，减少血浆置换次数及病死率，值得进行临床推广。

简介：

简介：摘要：课堂教学，是教师“教”与学生“学”相互结合后的综合结果，它更是一门艺术，是链接学生与教师之间知识和情感桥梁的关系纽带。但很多数学教师由于过分强调了学生考试的成绩，追求教学的“快”，因而忽视了学生积极学习情感、良好学习态度的培养，基于此，本文结合了“慢学习”的教育理念，希望可以重新定位数学教学的局面，拓展数学教学的深度，由此展开了相关的教学探讨。

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