哈蟆油的气相色谱指纹图谱研究

哈蟆油的气相色谱指纹图谱研究

尹蕊 、张靓岚、孟鑫

（黑龙江中医药大学药学院）

摘要：哈蟆油，产于东北的道地药材，具有补肾滋阴的功效。研究发现哈蟆油含有12种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸比例约为3:2[1-3]。哈蟆油中核酸等小分子类物质能够被皮肤吸收，可以加快细胞更新速度[4]。本研究旨在通过对哈蟆油进行气相色谱指纹图谱实验从而进一步完善哈蟆油的质量标准。对哈蟆油的质量标准研究，对哈蟆油中的脂肪酸成分进行气相色谱指纹图谱研究，气相色谱指纹图谱实验结果表明10批哈蟆油正品指纹图谱相似度达到0.94以上。

关键词：哈蟆油；质量标准；指纹图谱

1.实验仪器与试药

电子天平  常熟市天量仪器有限责任公司LT502E

医用冰箱冷藏箱青岛海尔特种电器有限公司HYC-610

水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司DK-98-11

气相色谱仪赛默飞世尔科技有限公司Trace 1300

石油醚(分析纯60-90℃)天津市富宇精细化工有限公司20201106

正己烷天津市富宇精细化工有限公司20201027

甲醇西陇化工股份有限公司20201206

1-甲基海因内酰脲标准品上海贤鼎生物科技有限公司200231

浓硫酸天津市申泰化学试剂有限公司20201105

HMY-2020110101黑龙江HMY-2020110106吉林

HMY-2020110102黑龙江HMY-2020110107吉林

HMY-2020110103黑龙江HMY-2020110108辽宁

HMY-2020110104黑龙江HMY-2020110109辽宁

HMY-2020110105吉林HMY-2020110110辽宁

2.实验方法

样品处理

分别将10批产地的哈蟆油药材样品干燥后粉碎碾细，过六号筛，备用。

哈蟆油脂肪酸的提取：精密称取各产地样品粉末0.50g置于索氏提取器中，于圆底烧瓶中加入石油醚（沸程60℃-90℃）60mL于90℃水浴提取8h，85℃水浴回收石油醚后得到淡黄色油状物0.05g，收率为10％，取所得油脂置于蒸发皿中90℃蒸干至薄膜状。

脂肪酸的甲酯化：向蒸发皿中加入4％的H2SO4甲醇溶液4mL，于60℃水浴反应90min，直至看不见油滴为止。

冷却后，向其中加入5mL正己烷溶液萃取脂肪酸酯，待其充分接触并溶解后取正己烷层作为供试品溶液密封保存，备用。

1-甲基海因（1-MH）标准品的配制：精密称量1-甲基海因标准品0.000051g于离心管中，向其中加入888μL甲醇溶液，溶解后即得0.5mmol/L溶液作为标准品母液备用。

GC色谱条件

TraceGOLD TG-WaxMS（30m×0.32m×0.25μm）毛细管柱，高纯氮气，流速为2.5mL/min

进样量为1μL，分流比60:1，进样口温度300℃，检测器（FID）温度300℃。升温速率为50，60，90，100，40，60（℃/min）；              目标值（℃）为50，130，145，165，180，250，300              ；保持时间（min）为2，1，1，1，2，2，2.程序流量条件为速率（mL/min/min）1，1；              目标值（mL/min）1，2.5，5；              保持时间（min）5，5，10.             

方法学考察

（1）精密度试验

取同一份供试药材样品，按如上方法连续测定6次，得到供试样品的气相色谱谱图，比对6次测定的气相色谱谱图，测得各共有峰相对峰面积的RSD小于2％，表明进样的精密度良好。

（2）稳定性试验

取同一份供试品样品溶液，分别于1h、2h、4h、6h、8h、12h进样，测得各共有峰相对峰面积的RSD小于2.5％，表明样品溶液在12h内稳定性良好。

（3）重复性试验

取同一批次的哈蟆油样品6份，分别进行哈蟆油脂肪酸的提取和甲酯化，将所得正己烷溶解的脂肪酸甲酯溶液分别进行气相色谱测定，比对6次测定的气相色谱谱图，计算各图谱间的相关系数及RSD值，由分析数据可知所有共有峰的相对峰面积的RSD均小于1％，结果表明，样品测定符合技术要求，方法重现性良好。

样品测定

向第一批哈蟆油提取液中加入0.1μL1-甲基海因标准品溶液，其他批次哈蟆油正常处理，将制备好的供试品溶液分别过0.45μm有机系微孔滤膜，按GC色谱条件进行气相色谱测定，得到供试样品气相色谱谱图。

按照以上测定方法，分别进行1-10号样品的气相色谱指纹图谱测定，得到不同产地的哈蟆油气相色谱指纹图谱。将10批哈蟆油脂肪酸指纹图谱同时导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”软件，以加入1-甲基海因标准品的样品图谱为参照谱，1-甲基海因色谱峰为参照峰，匹配共有峰，并生成标准指纹图谱。

3.实验结果

3.1气相色谱谱图分析

图1 指纹图谱特征模式

图2 10批样品GC叠加指纹图谱

哈蟆油指纹图谱特征模式如图1所示，从GC指纹图谱中可以分离出9个左右的主要峰，经比较，从中选定6个共有峰作为构成哈蟆油指纹图谱的稳定特征峰；在保留时间为3.970min时出现第一个峰；在保留时间5.467min出现第二个峰，在保留时间5.547min出现第三个峰，且第二个及第三个峰保留时间较为接近，峰面积也较为接近，分别为0.217与0.907；第四个峰的保留时间为7.075min，而第四个峰的峰面积占比较大，峰高较高；在保留时间为7.207min时出现第五个峰，且第五个峰的分离度较高，峰面积占比最大，为25.008；第六个峰的保留时间为7.763min，峰面积占比也较大，在所有的峰中排第二，为6.860；第七个峰出现在9.787min，但峰面积占比较小，只有0.082；第八个峰出现在11.049min，峰面积占比排第三，为5.016min，其他峰分离度较差，在总峰面积39.07中占比较低，讨论意义不大。

由图谱分析可知，各批次正品哈蟆油脂肪酸类物质差异较小，能够从哈蟆油提取物中检测出10种以上脂肪酸类化合物，尤其是不饱和脂肪酸类物质含量丰富，占比最多的为油酸、软脂酸和亚油酸，油酸占比28.5％，软脂酸占比22%，亚油酸占比13％。

各批次哈蟆油指纹图谱重叠图如图2，对哈蟆油特征指纹图谱进行分析后，选取其中较具有代表性的6个峰作为参考标准，以此对哈蟆油的质量标准进行判定，将不同批次的哈蟆油药材指纹图谱进行比对，并进行相似度分析，比对结果如表2-7所示。其中，第一批、第二批、第三批及第十批哈蟆油药材的相似度较高，均达到0.998。而其他样品之间似度也较高，分布在0.941-0.998之间，以此初步判定各批次哈蟆油中脂肪酸类物质组成差异较小。批号为             

HMY-2020110101，HMY-2020110102 ，HMY-2020110103，HMY-2020110104，HMY-2020110105，HMY-2020110106，HMY-2020110107，HMY-2020110108              ，HMY-2020110109，HMY-2020110110              相似度分别为0.998，0.998，0.998，0.943，0.949，0.954，0.989，0.941，0.947，0.998。

4.质量标准研究讨论

在气相色谱法对脂肪酸类物质检测部分，曾参考其他脂肪酸类文献气相色谱条件尝试性对哈蟆油脂肪酸提取物进行测定，但是结果不理想，出峰杂乱且多粘连，遂对哈蟆油气相条件进行探究摸索，分别进行进样量考察、分流比考察和程序升温考察，综合各项最优条件并做微调，选定最终条件即本实验条件。

参考文献

[1]张傲, 张悦, 陈缘, 翁强, 许美玉. 东北哈蟆油研究进展[J]. 养殖与饲料, 2020(01): 68-71.

[2]包玉晓. 哈蟆油化学成分的研究进展[J]. 畜牧兽医杂志, 2009, 28(03): 37-38.

[3]高利娜, 袁慧雅, 徐恩宇, 等. GC-MS法测定血中1-甲基海因含量及其法医学应用[J]. 法医学杂志, 2017, 06(v. 33; No. 154): 50-52.

[4]姜希红, 张爽, 刘树民. 哈蟆油化学成分及其鉴别方法研究进展[J]. 化学工程师, 2021, 35(02): 52-56.