β-elemene调节 Notch1基因和蛋白逆转乳腺癌细胞耐药性的机制研究

张珺 1 马春耕 2 邓恒 2

1 安徽中医药大学中医学院 安徽 合肥 230001 2 安徽中医药大学第二附属医院肛肠科 安徽 合肥 230001

摘要：多药耐药直接导致了乳腺癌化学治疗的失败，β-elemene是从中药莪术中提取的一种天然抗肿瘤成分，可以对抗肿瘤细胞的耐药性。药物阿霉素和多西紫杉醇被常用于乳腺癌的化学治疗，我们选择乳腺癌阿霉素耐药细胞(MCF-7/Adr)和乳腺癌多西紫杉醇耐药细胞(MCF-7/Doc)，采用MTT-cytotoxic、实时定量PCR、Western blotting等方法，研究β-elemene对乳腺癌耐药细胞生存率及Notch1、Bcl-2基因及蛋白表达的影响。证实了中药β-elemene可以通过影响Notch1、Bcl-2蛋白的表达的机制逆转乳腺癌耐药细胞的耐药性。

关键词：乳腺癌；耐药；β-elemene

乳腺癌是临床上女性常见的一种癌症之一^[1]，目前的治疗方法是手术与辅助化学治疗相结合，阿霉素(Adr)和多西他赛(Doc)是两种最常见的化疗药物^[2]。多药耐药(MDR)指长期接触化疗药物的肿瘤细胞可能对多种不同结构抗癌药物的不同靶点产生耐药性，研究表明，化疗耐受可能与90%癌症患者的死亡因素密切相关，乳腺癌治疗失败的重要原因也是原发性或获得性耐药^[3]。

从中草药莪术中分离出的单体elemene的提取物中包括β、γ、δ，其中γ-elemene和β-elemene为主要成分^[4]。研究证实β-elemene与ADR或DOC的联合治疗可以达到更高的肿瘤细胞抑制率和细胞死亡率，其中β-elemene逆转MCF-7细胞耐药性的机制与下调多药耐药蛋白的机制息息相关，比如通过抑制Pgp蛋白表达^[5]。Notch1、Bcl-2蛋白与多种肿瘤细胞的耐药性密切相关，其低的表达能够增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性^[6]。我们研究发现miRNA29a、miRNA452、miRNA34a及miRNA222的表达与乳腺癌耐药耐药性密切相关，并证实了中药β-elemene可以通过影响上述miRNA表达的机制增强乳腺癌耐药细胞对药物的敏感性。本研究表明，β-elemene可以通过调节Notch1、Bcl-2蛋白表达逆转乳腺癌的化学耐药性。

材料和方法

细胞培养

人乳腺癌细胞株MCF-7购自美国菌种中心 (马里兰州罗克维尔市)。我们通过将MCF-7培养于Doc或Adr浓度逐渐增加的培养基中的方法成功地构建出亲本细胞株MCF-7中耐药亚型，选择在100nm docetaxel (MCF-7/Doc)或500nm阿霉素(MCF-7/Adr)中。MCF-7/Adr和MCF-7/S细胞的半抑制浓度(导致一半细胞死亡浓度) Adr的值分别为403.56和0.66μm, MCF-7 / Doc和MCF-7 / S细胞半抑制浓度值分别是68.31μm和3.08μm。细胞系在高葡萄糖(HyClone)细胞培养基中培养,在37°C湿润气氛中含5%二氧化碳，补充10%胎牛血清(Gibco)。

MTT-cytotoxic

细胞播种到96孔板(6×103细胞/),不同浓度β-elemene处理和共同孵育48小时。然后20μl MTT的解决方案(5毫克/毫升)被添加到每一个细胞,维持在37°C，3 - 4小时。去除介质，添加二甲化砚(AMRESCO，美国)150mL;每个实验进行四次。利用CliniBio128 (ASYS-Hitech，奥地利)测定570nm的吸光度。

实时定量PCR

将各组细胞经裂解，采用Trizol方法提取组织总RNA，沉淀干燥后，再溶解RNA沉淀。逆转录使用 TaqMan® 微 RNA 逆转录工具包（应用生物系统公司，CA）；按照制造商的说使用TaqMan® 微RNA分析（应用生物系统公司，CA）。Notch 1、BCL-2 及GAPDH(内参)引物信息如表1，扩增条件及计算方法使用Clustal X 软件分析测定的miRNA序列，所有实验检测都进行3次。

表1 Notch 1、Bcl-2及GAPDH 引物信息

免疫印迹

在RIPA缓冲液(Beyotime，江苏，中国)中提取和溶解总蛋白。相同数量的蛋白质被10%的SDS-PAGE分离，转移到聚偏二氟乙烯膜(Sigma，德国)。阻止5%脱脂牛奶后,膜与初级孵化抗体人类PTEN和Pgp(1:100，Abcam,美国)一夜之间在4°C；用TBS洗涤后，进一步培养辣根过氧化物酶偶联二级抗体(康威有限公司，北京，中国);用pierce ECL试剂盒(Millipore, Billerica, MA)观察蛋白带。β-actin(1:4000 Bioworld，MN)作为一个内部负载规范化每个样本的表达模式。三个单独的实验显示了蛋白质的表达。

统计分析

所有实验进行三次，总结代表性数据。采用t检验或单因素方差分析进行统计分析，采用SPSS 16.0统计量进行Spearman秩检验。p<0.05认为有统计学意义。

结果

β-elemene能逆转乳腺癌耐药细胞的耐药性

β-elemene干预(50μm/L)30 h后MCF-7/Doc和MCF-7/Adr细胞分为两组，Doc和Doc中药干预组，Adr和Adr中药干预组。实验表明，β-elemene与MCF-7 / Doc或MCF-7 / Adr共同孵育可显著促进细胞凋亡，逆转药物抗性细胞。β-elemene对乳腺癌耐药细胞的耐药性的影响通过MTT法测试三组细胞的增殖抑制效果，计算吸光值，见表2。结果显示，MCF-7/ADR细胞的CDI大于对照组和β-elemene干预组，表明β-elemene能逆转乳腺癌耐药细胞的耐药性。

表2 三组细胞的CDI

β-elemene能逆转Notch 1和Bcl-2的mRNA的表达

Doc中药干预组和Adr中药干预组的细胞中 Notch1、Bcl-2 mRNA 表达量明显低于未干预的MCF-7 / Doc和MCF-7 / Adr细胞。差 异 有 统 计学意义( P ＜ 0． 05) ，具体见表3。

表3 Notch 1、Bcl-2及GAPDH 检测结果(x±s)

β-elemene调节乳腺癌耐药细胞Notch1、Bcl-2蛋白的表达

利用蛋白质印迹检测Notch1、Bcl-2表达变化。众所周知，Notch1、Bcl-2的表达在乳腺癌耐药中具有重要作用。与MCF-7细胞相比，MCF-7/Doc和MCF-7/Adr细胞中Notch1、Bcl-2表达显著增加，然而，MCF-7/Adr细胞和MCF-7/Doc细胞在-β-elemene (50μM/L)的干预下，和未经处理的MCF-7/Doc和MCF-7/Adr细胞相比，Notch1、Bcl-2的表达明显减少。

讨论

近50年以来世界范围内的乳腺癌发病率一直保持上升趋势。近些年我国乳腺癌发病率的增长速度逐渐高出西方发达国家。Adr和Doc是治疗乳腺癌常用的两种化疗药物，其治疗效果也随着肿瘤细胞对化疗药物的耐药而逐渐变差。90%癌症患者治疗失败与化疗耐受明显相关，也是乳腺癌治疗失败的重要原因。肿瘤的发生发展与异常基因表达的蛋白质有关，近年来的更多研究表明，肿瘤的发生发展以及肿瘤细胞的特异性都与特异蛋白质相关。β-elemene已广泛应用于中医肿瘤学中，之前国内文献报道它能够逆转化疗耐药性，在这项研究中,我们证明了β-elemene可以逆转乳腺癌细胞耐药，通过调及Notch1、Bcl-2蛋白有效敏化耐药BCA细胞。

这项研究β-elemene 能显著降低 Doc和Adr耐药细胞的细胞生存率，表明 β-elemene 可以逆转耐药，并显示 β-elemene 可以显著改变耐药蛋白的表达，其中Notch1、Bcl-2具有耐药性逆转的显著性改变。本实验结论，β-elemene可以调节Notch1与Bcl-2等耐药相关的蛋白表达减少乳腺癌的耐药性。

本研究通过β-elemene逆转肿瘤耐药性的分子机制研究为中西医结合治疗肿瘤提供了一个新颖的思路，如何建立中西医药物联合方案帮助改善乳腺癌化疗疗效。另外，将动物模型纳入研究会使我们的结论更具说服力，更希望下一步我们也可以从临床角度进一步探讨中药β-elemene的应用价值。

β-actin

β-actin

图1：Notch1、Bcl2蛋白表达量(图6A)、Pgp mRNA、Pgp蛋白表达量(图6B)在MCF-7、MCF-7/Adr细胞和MCF-7/Doc，β-elemene干预免疫印迹(50μm / L)。MCF-7 / Doc和MCF-7 / ADR细胞治疗DMSO(控制)或β-elemene30h，β-actin被用作免疫印迹的加载控制。代表模式显示了三个独立的实验,结果是一致的,* * # # P<0.01，MCF-7/Doc或MCF-7/Adr vs MCF-7/Doc +β-elemene。

参考文献

1. 张凌燕，阮祥燕，蔡桂举.他莫昔芬治疗转染孕激素受体膜组分1乳腺癌裸鼠模型对乳腺肿瘤组织Ki-67表达的影响[J].首都医科大学学报，2019,40（04）：533-538

2. 邓恒，束樱子，张珺.β－榄香烯在抗耐药机制中的研究进展及临床展望[J]. 辽宁中医杂志，2017，44（7）：1558-1560

3. Zhang Jun,Zhang He-da,Yao Yu-Feng.β-Elemene Reverses Chemoresistance of Breast Cancer Cells by Reducing Resistance Transmission via Exosomes[J]. Cell Physiol Biochem,2015,36(6):2274-2286 

4. Zhang Jun,Zhang He da,Chen Lin.β-elemene reverses chemoresistance of breast cancer via regulating MDR-related microRNA expression[J].Cell Physiol Biochem,2014,34(6):2027-2037

5. 邓恒,马春耕,张珺.β-elemene通过调节耐药特异性miRNA逆转乳腺癌细胞耐药性的机制研究[J].中医药临床，2019 ,31(5)：901-906

6. Kim Baek, Stephen Sam L, Hanby Andrew M.Chemotherapy induces Notch1-dependent MRP1 up-regulation, inhibition of which sensitizes breast cancer cells to chemotherapy[J].BMC Cancer,2015,15:634

* 基金项目：安徽省自然科学基金项目—基于微泡介导的微小RNA信息传递机制研究β-elemene抗乳腺癌耐药（NO.1808085MH302）

基金项目：安徽省自然科学基金项目

基于微泡介导的微小RNA信息传递机制研究β-elemene抗乳腺癌耐药

（NO.1808085MH302）