简介:摘要目的探讨人滋养层细胞表面抗原2(Trop2)在卵巢癌侵袭和转移中的作用及其分子机制。方法通过对Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)和The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库进行数据挖掘,分析Trop2表达的临床意义。采用Western blot法检测卵巢癌细胞系A3O、A1780和SKOV3中Trop2蛋白的表达。采用Trop2-shRNA构建SKOV3-shRNA细胞模型,以定量逆转录聚合酶链反应检测SKOV3-shRNA和SKOV3-NC组细胞中SKOV3 mRNA的表达,以细胞计数盒8法检测SKOV3-shRNA组和SKOV3-NC组细胞的增殖,以流式细胞仪检测SKOV3-shRNA和SKOV3-NC组细胞的细胞周期和凋亡,以Transwell实验检测SKOV3-shRNA和SKOV3-NC组细胞的侵袭和迁移,以Western blot法检测SKOV3-shRNA和SKOV3-NC组细胞中AKT、p-AKT、β-catenin、caspase3、bcl-2、E-cadherin和vimentin蛋白的表达。结果Trop2 mRNA在卵巢癌中高表达,其表达高低与肿瘤分期有关,也与患者预后有关。与A3O细胞比较,A1780和SKOV3细胞高表达Trop2蛋白(P<0.05)。SKOV3-NC组和SKOV3-shRNA组中Trop2 mRNA的相对表达量分别为1.18±0.24和0.42±0.08,差异有统计学意义(P<0.05)。SKOV3-NC组细胞的活力明显高于SKOV3-shRNA组(P<0.05)。SKOV3-NC和SKOV3-shRNA组G0/G1期细胞的比例分别为(38.67±4.22)%和(60.24±8.17)%,SKOV3-shRNA组细胞阻滞于G0/G1期(P<0.05)。SKOV3-shRNA组细胞的凋亡率为(26.32±1.81)%,明显高于SKOV3-NC组[(6.54±1.32)%,P<0.05]。SKOV3-shRNA组和SKOV3-NC组SKOV3细胞的迁移细胞数分别为(1 255.83±108.44)个/视野和(1 679.71±213.92)个/视野,侵袭细胞数分别为(242.49±52.09)个/视野和(473.54±73.11)个/视野,与SKOV3-NC组比较,SKOV3-shRNA组的迁移和侵袭细胞数均明显减少(均P<0.05)。SKOV3-shRNA细胞中p-AKT、bcl-2、vimentin、β-catenin表达下调,caspase3、E-cadherin表达上调,总AKT没有明显变化。结论Trop2的表达与卵巢癌分期和预后有关,Trop2可通过激活AKT/β-catenin信号通路促进卵巢癌细胞增殖和转移,沉默Trop2的表达可以抑制卵巢癌进展。
简介:摘要目的探讨人滋养层细胞表面抗原2(Trop2)在卵巢癌侵袭和转移中的作用及其分子机制。方法通过对Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)和The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库进行数据挖掘,分析Trop2表达的临床意义。采用Western blot法检测卵巢癌细胞系A3O、A1780和SKOV3中Trop2蛋白的表达。采用Trop2-shRNA构建SKOV3-shRNA细胞模型,以定量逆转录聚合酶链反应检测SKOV3-shRNA和SKOV3-NC组细胞中SKOV3 mRNA的表达,以细胞计数盒8法检测SKOV3-shRNA组和SKOV3-NC组细胞的增殖,以流式细胞仪检测SKOV3-shRNA和SKOV3-NC组细胞的细胞周期和凋亡,以Transwell实验检测SKOV3-shRNA和SKOV3-NC组细胞的侵袭和迁移,以Western blot法检测SKOV3-shRNA和SKOV3-NC组细胞中AKT、p-AKT、β-catenin、caspase3、bcl-2、E-cadherin和vimentin蛋白的表达。结果Trop2 mRNA在卵巢癌中高表达,其表达高低与肿瘤分期有关,也与患者预后有关。与A3O细胞比较,A1780和SKOV3细胞高表达Trop2蛋白(P<0.05)。SKOV3-NC组和SKOV3-shRNA组中Trop2 mRNA的相对表达量分别为1.18±0.24和0.42±0.08,差异有统计学意义(P<0.05)。SKOV3-NC组细胞的活力明显高于SKOV3-shRNA组(P<0.05)。SKOV3-NC和SKOV3-shRNA组G0/G1期细胞的比例分别为(38.67±4.22)%和(60.24±8.17)%,SKOV3-shRNA组细胞阻滞于G0/G1期(P<0.05)。SKOV3-shRNA组细胞的凋亡率为(26.32±1.81)%,明显高于SKOV3-NC组[(6.54±1.32)%,P<0.05]。SKOV3-shRNA组和SKOV3-NC组SKOV3细胞的迁移细胞数分别为(1 255.83±108.44)个/视野和(1 679.71±213.92)个/视野,侵袭细胞数分别为(242.49±52.09)个/视野和(473.54±73.11)个/视野,与SKOV3-NC组比较,SKOV3-shRNA组的迁移和侵袭细胞数均明显减少(均P<0.05)。SKOV3-shRNA细胞中p-AKT、bcl-2、vimentin、β-catenin表达下调,caspase3、E-cadherin表达上调,总AKT没有明显变化。结论Trop2的表达与卵巢癌分期和预后有关,Trop2可通过激活AKT/β-catenin信号通路促进卵巢癌细胞增殖和转移,沉默Trop2的表达可以抑制卵巢癌进展。
简介:摘要目的探讨anti-PD-1(scFv)/hIL-15(简称PD-15)融合蛋白体外特异性结合PD-1的能力及联合GF-hIL-15Ra-K562(简称G15Ra-K562)滋养细胞对自然杀伤细胞(NK)/T细胞增殖能力的影响。方法Overlap PCR构建G15Ra表达载体,电穿孔仪转染K562,极限稀释法获取G15Ra-K562滋养细胞单克隆株。酶切连接构建PD-15表达载体,Lipofectamine™ 2000瞬时转染HEK293T细胞并获取包含PD-15融合蛋白的条件培养液。密度梯度离心获取人外周血单个核细胞,CFSE染色标记活跃增殖细胞。流式细胞术检测PD-15特异性结合PD-1的能力和对人外周血单个核细胞的增殖及不同淋巴亚群比例的影响。结果成功构建高表达融合蛋白G15Ra的滋养细胞单克隆株G15Ra-K562。添加hIL-15能够将G15Ra-K562滋养细胞扩增人外周血淋巴细胞能力提升5倍以上(P<0.05)。PD-15融合蛋白具有PD-1特异性结合能力(P<0.001),联合G15Ra-K562滋养细胞能够在体外高效扩增人外周血来源的NK/T细胞(P<0.05),扩增得到的细胞产品中以NK、CD8+T和CD4+T细胞为主。结论PD-15融合蛋白能够特异性靶向PD-1分子且在联合G15Ra-K562滋养细胞后具有强的人外周血来源的NK/T细胞扩增能力,建立了分步、靶向递送IL-15/IL-15Ra复合物至PD-1+细胞的细胞培养方案,为后续选择性扩增PD-1+细胞提供实验资料。