简介:摘要目的探究新生小鼠肠道类器官的发育成熟过程,为围产期胎儿/新生儿肠道上皮发育及相关疾病的研究提供新模型。方法取3日龄C57BL/6小鼠肠道组织,利用标准条件培养肠道类器官,传代培养至第5代。利用倒置相差显微镜观察并记录各代肠道类器官形态变化。利用实时荧光定量聚合酶链反应和免疫荧光技术检测各代肠道类器官中肠道干细胞及肠道上皮各类型分化细胞标志物的表达及组织细胞定位(选取的标志基因:肠道干细胞:Lgr5;胎儿期肠道祖细胞:Tpm2和Gja1;肠道上皮细胞:Villin;帕内特细胞:Lyz1;杯状细胞:Muc2;内分泌细胞:Chga;选取的各细胞标志蛋白:肠上皮细胞:绒毛蛋白;杯状细胞:黏蛋白2;内分泌细胞:嗜铬粒蛋白A;帕内特细胞:溶菌酶)。采用单因素方差分析和Bonferroni检验进行统计学分析。结果新生小鼠肠道类器官中存在不成熟的球状体和具有隐窝-绒毛结构的成熟型类器官这2种类型。原代培养物中以球状体为主要形态,占(96.61±1.36)%;从原代至传代第2代间,类器官形态变化表现为球状体比例明显下降[第2代占比下降至(8.93±1.50)%],且面积缩小(F=12.88,P<0.001);第2代至第5代类器官的形态以成熟类器官为主,占比从(91.07±1.50)%升至(95.56±2.14)%。肠道干细胞标志基因Lgr5的表达在从原代传代到第2代之间降低(F=76.75,P<0.001),第2代Lgr5表达为原代的0.40±0.06,在第2代之后上升。胎儿期肠道祖细胞标志基因Tpm2表达在传代中明显下降(原代1.00±0.11,第5代0.003±0.001,F=148.00,P<0.001);Gja1的表达在原代(1.00±0.14)至第2代(0.06±0.04)间下降(F=197.10,P<0.001),在第2代后保持稳定低表达(F=2.20,P=0.13)。肠道上皮内各类型分化细胞(肠上皮细胞、杯状细胞、内分泌细胞和帕内特细胞)的标志基因表达在传代第2代之后呈现升高趋势(Villin:第2代0.46±0.11,第5代1.02±0.05;Muc2:第2代0.68±0.29,第5代8.79±0.61;Chga:第2代2.53±0.16,第5代4.32±0.45;Lyz1:第2代0.98±0.21,第5代3.81±0.36;P值均<0.05)。免疫荧光染色结果显示,在原代及第5代培养物中,肠上皮细胞标志蛋白绒毛蛋白均沿肠道类器官绒毛侧分布。杯状细胞标志蛋白黏蛋白2及内分泌细胞标志蛋白嗜铬粒蛋白A在原代中表达很低,而到第5代中染色明显。在原代培养物中帕内特细胞标志蛋白溶菌酶弥散性均匀分布在类器官细胞内,而在第5代中可见高荧光强度点状表达。结论新生小鼠肠道类器官的连续培养可模拟未成熟肠道上皮的发育成熟过程。原代至传代第2代类器官也许可作为胎儿至新生儿期肠道上皮发育的研究模型,传代第2~5代类器官也许可作为新生儿期肠道疾病研究的新模型。
简介:目的对经典Vannucci法进行改进,建立一种简便、稳定的新生小鼠缺血缺氧脑损伤模型。方法将新生11d的KM小鼠分为正常对照组(N组,n=20)和缺血缺氧组(HIBD组,n=160),对HIBD组行左侧颈总动脉结扎,分别按照C1-C8条件缺氧建模。建模后通过比较各条件下小鼠死亡率、建模成功率和TTC染色脑梗死体积,选取最稳定的建模条件。建模后利用体重生长曲线分析小鼠生长发育情况;Longa、Griptest、悬吊试验评估小鼠神经运动功能;HE染色观察脑组织病理改变。结果新生小鼠行左侧颈总动脉结扎,8%O_2、35℃条件下缺氧45min,死亡率低(8.3%)且成模率高(47.92%);HIBD组较N组小鼠体重增长缓慢并出现严重的神经运动功能障碍;结扎侧出现脑梗死区,约占全脑体积(17.76±0.70)%;结扎侧大脑皮层及海马区神经元出现变性坏死。结论本实验采用新生小鼠行左侧颈总动脉结扎,在8%O2、35℃条件下缺氧45min复制HIBD动物模型,简便且稳定性好,是用于新生儿缺血缺氧性脑损伤研究较为理想的动物模型。
简介:目的:观察出生后小鼠不同部位皮肤毛囊早期发育生长差异及细胞色素C的表达分布。方法对新生1~9日龄的KM小鼠背部、尾部和触须部皮肤取材,进行HE染色,用二步法免疫组织化学对组织进行细胞色素C进行表达分布检测。结果新生小鼠不同部位皮肤毛囊发育差异很大,这种差异不仅体现在形态差异上,而发育时间的差异也十分明显。小鼠出生后背部皮肤和尾部皮肤的毛囊发育都经过了一个非线性的发育和生长期,过了非线性的发育和生长期才开始快速生长,相比较尾部发育略迟于背部。触须部毛囊发育特征和背部尾部差异很大,一出生便可看到较成熟的触毛,没有经过稳定期便开始发育。结论通过形态学比较,结合CytC表达分布水平,发现新生小鼠不同部位皮肤毛囊早期发育存在形态和时间上的差异。
简介:目的:研究富含半胱氨酸蛋白61(CCN1/Cyr61)在氧诱导小鼠视网膜新生血管(retinalneovascularization,RNV)中的表达及意义,探讨特异性抑制CCN1对RNV形成的抑制作用。方法:取C57BL/6J小鼠200只,随机分为对照组、高氧组、高氧对照组和CCN1治疗组,每组各50只。高氧对照组和CCN1治疗组分别玻璃体腔内注射空载体质粒和CCN1siRNA表达质粒。ADP酶视网膜铺片观察视网膜血管形态,HE染色计数突破视网膜内界膜的新生血管内皮细胞核数,免疫组织化学、Westernblot和RT-PCR法检测CCN1蛋白及mRNA的表达情况。结果:高氧组和高氧对照组视网膜可见大片无灌注区和大量突破内界膜的新生血管内皮细胞核(25.25±1.26个;23.12±1.16个),CCN1治疗组较高氧组和高氧对照组的无灌注区及新生血管内皮细胞核数(8.47±1.15个)明显减少。高氧组和高氧对照组较对照组相比,CCN1蛋白及mRNA表达显著增高,CCN1治疗组较高氧组和高氧对照组显著减弱,均有统计学意义(均为P〈0.05)。结论:CCN1的异常表达可能与RNV形成密切相关,特异性抑制CCN1能有效抑制RNV的形成,为预防和治疗ROP提供新的思路及对策。
简介:摘要目的探讨外源性小肠类器官(intestinal organoid,IO)肠道内灌注对坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)新生小鼠肠道损伤的影响及相关机制,为探索NEC新型防治方法及临床转化提供依据。方法取9日龄健康C57BL/6新生小鼠末端回肠组织体外培养IO,培养7 d后鉴定IO并将其重悬于磷酸盐缓冲溶液用于干预实验。选用5日龄C57BL/6新生小鼠,按照随机数字法随机分成4组:正常对照组(control组,仅母鼠母乳喂养,无其他干预措施)、实验对照组(control+IO组,母鼠母乳喂养,于生后第6天进行类器官干预)、NEC组(于生后第5至9天之间,诱导新生鼠NEC发生)、实验干预组(NEC+IO组,诱导NEC同时于生后第6天进行类器官干预),每组5只小鼠。生后第9天收集各组新生小鼠末端回肠组织,分析比较各组小鼠肠道损伤程度,肠道炎症反应,肠道干细胞活性、肠上皮细胞增殖能力变化并进一步比较各组Wnt/β-catenin通路活性。计量资料多组间比较采用ANOVA检验,单因素方差分析后进一步两两比较使用LSD检验;计数资料多组比较采用Kruskal-Wallis非参数检验;生存分析采用Log-rank(Mantel-cox)检验。结果与control组相比,NEC组小鼠累积存活率显著降低(NEC组比control组:100.00%比42.42%,P<0.001),肠道组织病理评分[NEC组比control组:3(2.5~3)比0(0~0.5),P<0.01]与IL-6 mRNA表达水平[NEC组比control组:(4.52±0.82)比(1.01±0.23),P<0.001]均明显升高,而Lgr5 mRNA表达水平[NEC组比control组:(0.02±0.01)比(1.03±0.40),P<0.001]、Ki-67 mRNA表达水平[NEC组比control组:(0.18±0.06)比(1.00±0.15),P<0.001]显著下降,单个隐窝内Ki-67+细胞个数[NEC组比control组:(3.17±2.04)比(9.17±1.47),P<0.001]明显减少,β-catenin mRNA表达水平[NEC组比control组:(0.01±0.01)比(1.23±0.42),P<0.05]及β-catenin蛋白活化水平(即非磷酸化β-catenin)[NEC组比control组:(0.14±0.04)比(0.92±0.41),P<0.001]明显降低。而相较于NEC组,NEC+IO组小鼠累积存活率显著提高(NEC组比NEC+IO组:42.42%比69.84%,P<0.001),NEC病理评分[NEC组比NEC+IO组:3(2.5~3)比0(0~1.5),P<0.05]与IL-6 mRNA表达水平[NEC组比NEC+IO组:(4.52±0.82)比(1.04±0.18),P<0.001]均显著降低,Ki-67 mRNA表达水平[NEC组比NEC+IO组:(0.18±0.06)比(0.37±0.10),P<0.05]升高,单个隐窝内Ki-67+细胞个数明显增加[NEC组比NEC+IO组:(3.17±2.04)比(12.67±1.51),P<0.001]。此外,肠道β-catenin mRNA表达水平[NEC组比NEC+IO组:(0.01±0.01)比(2.44±1.19),P<0.001]及β-catenin蛋白活化水平[NEC组比NEC+IO组:(0.14±0.04)比(0.54±0.25),P<0.05]均升高。结论外源性IO可以缓解NEC肠道损伤,抑制肠道炎症反应,提高肠道内细胞增殖水平,改善肠道干细胞活性,Wnt/ β-catenin信号通路可能参与介导了上述IO干预作用。
简介:摘要目的探讨宫内急性缺血缺氧对新生小鼠肺组织降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)表达的影响,为临床治疗新生缺血缺氧肺损伤提供依据。方法选取孕龄21 d的Wistar大鼠7只,适应性喂养后分为3组:正常对照组(n=2)、假手术对照组(n=6)、缺血缺氧组(n=6)。结扎21 d剖腹的Wistar大鼠的一侧子宫角的血管(卵巢及宫颈两端均结扎),结扎一侧的宫内胎鼠为缺血缺氧组,另外一侧子宫角的血管不予结扎,其宫内胎鼠为假手术对照组。另外设21 d正常剖腹胎鼠为正常对照组,采用放射免疫标记法与RT-PCR观察肺组织CGRP与a-CGRP mRNA、β-CGRP mRNA的表达。结果缺血缺氧组在缺氧20 min、30 min与40 min时a-CGRP mRNA[(0.775±0.549)比(0.487±0.035),(0.886±0.045)比(0.516±0.072),(1.015±0.110)比(0.501±0.474)]、β-CGRP mRNA[(0.582±0.054)比(0.289±0.079),(0.564±0.025)比(0.349±0.009),(0.679±0.071)比(0.382±0.022),P<0.001]的表达均高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。肺组织匀浆中CGRP的表达随着缺氧时间的延长而增加,在缺血缺氧20 min[(1 632.170±54.963)比(1 135.000±15.556)、30 min[(1 745.000±61.410)比(1 196.000±53.740)]、40 min[(2 098.670±130.029)比(1 211.500±109.602)]时的相对值均高于正常对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论宫内缺血缺氧可以引起新生小鼠肺组织、a-CGRP、β-CGRP mRNA与CGRP的表达增加,并且随着缺血缺氧时间的延长而增加。本研究对宫内缺血缺氧新生儿急性肺损伤提供了新的治疗思路。
简介:目的分析新生隐球菌荚膜多糖GXM对小鼠神经小胶质细胞能量代谢和凋亡的影响.方法①采用紫外分光光度计检测GXM干预后的神经小胶质细胞能量产物ATP含量的改变情况.②采用AnnexinV-异硫氰酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)双标记法流式细胞术检测GXM细胞诱导神经小胶质细胞凋亡的情况.结果①GXM体外可诱导神经小胶质细胞产ATP能力下降.②GXM体外可诱导神经小胶质细胞的凋亡.结论新生隐球菌可通过GXM诱导能量代谢紊乱和凋亡来对神经小胶质细胞产生影响.
简介:摘要目的运用坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis, NEC)新生小鼠模型,探讨β-胡萝卜素对NEC新生小鼠肠道损伤的作用。方法选用5日龄C57BL/6新生小鼠15只,按随机数字法分为三组,每组5只。对照组:母鼠哺乳喂养,无其他任何干预;NEC组:通过对新生小鼠缺氧刺激,人工喂养及脂多糖干预诱导产生NEC;β-胡萝卜素干预组:在诱导产生NEC的同时,给予新生小鼠胃管灌注β-胡萝卜素(1 mg/kg)。于生后第9日收集各组新生小鼠末端回肠组织,分析比较NEC病理评分,肠道炎症反应,肠上皮细胞增殖、凋亡及氧化应激水平。结果与对照组相比,NEC组肠道出现明显损伤(0/5比5/5,P<0.05),炎症反应(1.0122±0.03比9.5367±3.025,P<0.01)及氧化应激水平(TBARS 6.9292±0.129比11.4420±0.074,P<0.01; GPx 25.21±7.113比17.5674±5.769,P<0.01)明显升高,肠上皮细胞增殖能力下降(5.36±0.308比1.48±0.212,P<0.01),且凋亡增多(2.5683±0.39比5.4974±0.967,P<0.01);与NEC组相比,β-胡萝卜素干预组的肠道组织损伤程度明显降低(5/5比1/5,P<0.05),肠道组织炎症减轻(9.5367±3.025比5.7871±1.489,P<0.01),氧化应激水平明显下降(TBARS 11.4420±0.074比8.1148±0.013,P<0.01;GPx 17.5674±5.769比35.1576±11.077,P<0.01),肠道上皮细胞增殖能力增强(1.48±0.212比3.8±0.1,P<0.01),凋亡减少(5.4974±0.967比3.7773±0.772,P<0.05);干预组肠道组织损伤程度及凋亡水平较NEC组有所改善的同时,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论β-胡萝卜素可通过降低肠道氧化应激水平来减轻NEC新生小鼠肠道损伤程度,缓解肠道炎症反应,促进肠上皮细胞增殖并抑制细胞凋亡。提示β-胡萝卜素对NEC新生小鼠肠道损伤具有保护作用。
简介:目的研究PINK1基因对缺氧缺血性脑损伤新生小鼠细胞凋亡及细胞自噬的影响。方法将野生型和PINK1基因敲除型新生小鼠各72只分为野生型假手术组(SWT)、野生型模型组(MWT)、基因敲除假手术组(SKO)及基因敲除模型组(MKO)。模型组小鼠行右侧颈总动脉结扎后置于低氧舱中(含8%氧气和92%氮气)2.5h,假手术组不予结扎和低氧处理。缺氧缺血处理后24h,采用TTC染色法检测各组新生小鼠脑梗死程度;采用免疫组化法检测各组脑组织中活化型半胱天冬酶-3(CC3)的表达;采用TUNEL法检测细胞凋亡;采用免疫荧光法及Westernblot法检测细胞自噬相关蛋白LC3的表达。结果MKO组小鼠脑组织梗死程度较MWT组小鼠明显减轻(P〈0.05);脑组织凋亡阳性细胞数明显减少,凋亡指数降低(P〈0.05);凋亡蛋白CC3表达显著减少(P〈0.05)。MKO组小鼠自噬相关蛋白LC3表达较MWT组减少,进一步检测证实自噬指标LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值较MWT组降低(P〈0.05)。结论敲除PINK1基因对新生鼠缺血缺氧脑损伤具有神经保护作用。