简介:目的用合成仪自动地合成60mer寡核苷酸SARS冠状病毒的探针来制作寡核苷酸基因芯片。方法根据寡核苷酸探针的制作要求,选取SARS冠状病毒的特异序列30条、长度为60mer的片段进行合成,并对合成后的纯化方法与条件进行探索。将经12%变性PAGE胶纯化后的探针直接点样制备成12×12阵列的寡核苷酸的基因芯片,初步与处理后的临床样品进行杂交。结果经PAGE纯化的寡核苷酸探针的纯度高,能满足寡核苷酸芯片制备的要求。临床SARS患者标本进行处理后与寡核苷酸芯片杂交、扫描检测,效果较好。结论本室合成的60mer的寡核苷酸SARS冠状病毒探针能用于基因芯片的制备与检测,这为该疾病的实验室诊断提供了一种快速、平行的检测方法。
简介:以3缩水甘油环氧丙基三甲氧基硅烷对玻璃基片表面进行硅烷化后,用下列4种方法组装手臂分子:①盐酸直接处理;②先用聚六乙二醇,然后用盐酸处理;③用乙二胺、戊二醛、乙醇胺和硼氢化钠分别处理;④用聚六乙二醇、乙二胺、戊二醛、乙醇胺和硼氢化钠分别处理.用XPS(X-rayphotoelectronspectroscopy)和测定接触角的方法对上述组装进行了表征,并用直接偶联荧光单体及合成20mer寡核苷酸与带荧光的互补探针杂交的方法对上述手臂分子的合成效率及杂交效率进行了考察.实验表明方法③组装的手臂分子得到的结果优于其他3种方法,证明了手臂分子的空间效应、亲水性等性质对寡核苷酸合成和杂交存在影响.
简介:目的探讨bcl-xl反义寡核苷酸(ASODN)在裸鼠人鼻咽癌移植瘤细胞中的吸收和分布。方法应用流式细胞仪检测MCF和PPSC;用荧光显微镜观察ASODN在移植瘤细胞内的定位和分布。结果流式细胞仪检测结果显示,对照组、ASODN组和ASODN/Lip组MCF值分别为0.22±0.25,1.76±0.56和2.04±0.67;PPSC的平均值分别为(1.30±0.40)%,(45.5±8.63)%和(50.6±4.75)%,后两组与对照组比较差异有显著意义,ASODN组和ASODN/Lip组比较均无显著性差异(P<0.05),荧光显微镜观察到ASODN主要分布在细胞浆和细胞核内。结论裸鼠移植瘤鼻咽癌细胞可有效地摄取ASODN,且ASODN主要分布在细胞浆和细胞核内。在本实验条件下未观察到脂质体促进ASODN向细胞内转运,只是可能改变了ASODN的分布,主要分布在细胞核内。
简介:目的探讨c—myc反义基因联合干扰素α对人肝癌细胞端粒酶活性表达的影响。方法将c—myc反义寡核苷酸及IFN-α2b分别和联合作用于体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721,应用免疫组化、RT-PCR和PCR-ELISA等方法,观察c—myc蛋白、端粒酶亚单位及其活性表达的影响。结果10μmol/L浓度的c-myc反义寡核苷酸和5000U/mL浓度的FN-α2b分别作用于SMMC-772124h、48h后,相应的c—myc蛋白、端粒酶催化亚单位hTERTmRNA及端粒酶活性与空白对照组相比,差异有显著性(P<0.05或P<0.01);而联合组,其抑制c-myc蛋白、端粒酶催化亚单位hTERTmRNA及端粒酶活性的表达大于其单独治疗组,且差异有显著性(P<0.05或P<0.01)。结论c—myc反义寡核苷酸联合IFN-α抑制端粒酶的活性大于其单独作用。
简介:目的研究视网膜色素上皮(retinalpigmentepithelium,RPE)细胞中端粒酶逆转录酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)表达及其反义寡核苷酸(antisenseolgonucleotides,ASODN)对其表达和细胞增生的抑制作用,为增生性玻璃体视网膜病变(prliferativevitreoretinopathy,PVR)治疗探索基因治疗新途径.方法体外培养兔眼RPE细胞,在不同时间采用链霉亲合素-生物素化过氧化物酶复合物(strepoavidin-biotin-enzymecomplex,SABC)免疫组织化学法检测TERT的表达;不同浓度的TERTASODN和正义寡核苷酸(senseoligodeoxynucleotides,SODN)分别作用于体外培养的RPE细胞,采用免疫组织化学方法检测TERT的表达;四唑盐比色法(MTT)检测在不同浓度的TERTASODN和SODN作用下RPE细胞生长活性及其生长抑制率.结果体外培养兔眼RPE细胞可表达TERT,在5,10μmo/LASODN作用下,TERT的表达明显受抑制;TERTASODN能明显抑制RPE细胞增生活性,并呈剂量依赖性.结论TERTASODN能序列特异性地抑制RPE细胞TERT表达和增生活性.
简介:目的获得东方田鼠的特异DNA序列.方法Aβ基因使用PCR,基因克隆,斑点杂交,DNA序列分析,生物信息学技术.结果根据小鼠MHCⅡ外显子2及其两侧序列,合成引物并扩增东方田鼠基因组DNA,将PCR产物回收、测序后,分别设计内引物扩增东方田鼠基因组DNA,其中一对引物可得到特异性扩增带,将得到的DNA片段插入PGEM-Teasy载体,进行序列分析.用这对引物扩增人、昆明小鼠、BALB/c小鼠及C57BL/6J小鼠基因组DNA,均无扩增产物.以东方田鼠特异性扩增产物为探针进行斑点杂交,除东方田鼠基因组DNA外,其他几种动物基因组DNA均为阴性结果.进一步对该DNA片段进行了BLAST同源性搜索和外显子预测,在Genbank中没有发现高度同源序列,并且找到一个可能的外显子,该外显子由69个氨基酸组成.结论获得的DNA片段为东方田鼠的特异片段,这将为从分子水平深入研究东方田鼠的遗传背景、生物进化规律以及东方田鼠抗日本血吸虫的机理奠定基础.
简介:本研究探讨HLA新的等位基因HLA-B*4061的分子基础。采用盐析法抽提样本DNA,利用PCR方法扩增先证者HLA-B基因的第1-8外显子,PCR产物直接经TOPO克隆到质粒载体中得到单链,对所得克隆进行HLA-B基因第2、3、4外显子双向测序分析。应用PCR-SSP方法证实测序所发现的突变。结果表明:先证者样本克隆测序得到2个等位基因,其中1个等位基因为B+4601,另1个经blast验证其为新的等位基因,新的等位基因序列已递交GenBank(DQ089628,DQ089629,DQ089630)。与最接近的B*400101等位基因序列相比,新的等位基因仅在第2外显子上有1个核苷酸不同,即第272位C→A,导致第67位氨基酸Ser→Tyr。结论:HLA-B*4061等位基因为新的HLA-B等位基因,已荣获世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名。
简介:目的:癌细胞膜上Pgp糖蛋白的过量表达是肿瘤多药抗性的主要机制。人体内编码Pgp糖蛋白的基因中仅有mdr1涉及多药抗性。本研究中设计了针对mdr1的反义核酸与阿霉素的偶联物,并且对其细胞毒性进行了考察。同时对偶联物对人表皮癌细胞株KBA1内的Pgp蛋白的表达也做了分子水平上的研究。方法:使用MTT法考察偶联物对KBA1细胞的毒性。用HPLC考察偶联物对细胞内阿霉素的积累量的影响。对于Pgp蛋白表达的变化,主要是通过RTPCR及WesternBlot方法进行了研究。结果:偶联物的细胞毒性比寡核苷酸高。在低剂量的偶联物(0.5μmol·L-1)的作用下,细胞对阿霉素的敏感性提高。偶联物能有效的提高细胞内阿霉素的积累量。并且从RTPCR及WesternBlot看,偶联物处理后的细胞内Pgp表达最少。结论:选用合适的基团,对反义核酸进行结构修饰能够较好的增强反义核酸的性能。采用阿霉素作为偶联基团尽管增强了细胞毒性,但是在更大程度上增强了其抑制Pgp蛋白的效力,提高了肿瘤耐药性的逆转倍数,具有一定的潜在应用价值。更多还原