简介：摘要目的探讨M1型小胶质细胞源性外泌体（M1-exo）对氧糖剥夺/复氧后神经元损伤的影响，并研究其作用机制。方法取对数期生长的小鼠小胶质细胞BV2，加入100 μg/L脂多糖（LPS）和20 μg/Lγ-干扰素（IFN-γ）诱导小胶质细胞极化为M1表型，通过蛋白质免疫印迹试验（Western blotting）、实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）、免疫荧光法鉴定M1型小胶质细胞。收取M1型小胶质细胞的上清液，用ExoQuick-TCTM试剂盒提取M1-exo，通过透射电镜及纳米颗粒粒径分析（NTA）观察外泌体形态，采用Western blotting法检测外泌体标记蛋白白细胞分化抗原（CD9、CD63）的表达。将生长良好的小鼠神经母细胞瘤细胞N2a分为6组：C组细胞常规培养；O组氧糖剥夺3 h后复糖复氧24 h制备N2a细胞氧糖剥夺/复氧损伤模型；E组的N2a细胞氧糖剥夺3 h后复糖复氧并与M1-exo共培养24 h；NC组、M组和I组分别构建阴性对照、过表达和敲低微小RNA-20a-5p（miR-20a-5p）的M1-exo，通过qPCR检测转染是否成功。NC组、M组和I组N2a细胞氧糖剥夺3 h后，与转染后的M1-exo共培养24 h后检测各项指标。采用细胞增殖检测试剂（CCK-8）法检测细胞活力，采用流式细胞术检测细胞凋亡，采用qPCR法检测miR-20a-5p表达。结果与M0型小胶质细胞相比，M1型小胶质细胞特异性标志物CD32和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）荧光强度及其mRNA和蛋白表达均明显升高〔CD32（荧光强度）：36.919±1.541比3.533±0.351，CD32 mRNA（2-ΔΔCt）：4.887±0.031比1.003±0.012，CD32/β-actin：2.663±0.219比1.000±0.028；iNOS（荧光强度）：29.513±1.197比7.933±0.378，iNOS mRNA（2-ΔΔCt）：4.829±0.177比1.000±0.016，iNOS/β-actin：1.991±0.035比1.000±0.045；均P<0.01〕，证明M1型小胶质细胞被成功激活。电镜下可见M1-exo为圆形或卵圆形囊泡状小体，并有明显膜性结构，直径范围约100 nm。Western blotting结果显示，M1-exo表达特异性CD63和CD9蛋白。与C组比较，O组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达明显升高〔细胞活力（A值）：0.540±0.032比1.001±0.014，细胞凋亡率：（19.857±0.910）%比（13.508±0.460）%，miR-20a-5p（2-ΔΔCt）：5.508±0.291比1.033±0.101，均P<0.01〕。与O组比较，E组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达进一步升高〔细胞活力（A值）：0.412±0.029比0.540±0.032，细胞凋亡率：（31.802±0.647）%比（19.857±0.910）%，miR-20a-5p（2-ΔΔCt）：8.912±0.183比5.508±0.291，均P<0.01〕，说明M1-exo进一步加重了氧糖剥夺/复氧后N2a细胞的损伤。与E组比较，M组N2a细胞活力明显下降，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显升高〔细胞活力（A值）：0.311±0.028比0.412±0.029，细胞凋亡率：（36.343±0.761）%比（31.802±0.647）%，miR-20a-5p（2-ΔΔCt）：32.348±0.348比8.912±0.183，均P<0.01〕；而I组N2a细胞活力明显升高，细胞凋亡率和miR-20a-5p表达明显下降〔细胞活力（A值）：0.498±0.017比0.412±0.029，细胞凋亡率：（26.437±0.793）%比（31.802±0.647）%，miR-20a-5p（2-ΔΔCt）：6.875±0.219比8.912±0.183，均P<0.01〕。E组与NC组N2a细胞活力、细胞凋亡率和miR-20a-5p的表达比较差异均无统计学意义。结论M1-exo加重氧糖剥夺复氧后神经元的损伤，这一损伤作用可能与其携载的miR-20a-5p有关。