LncRNA IRAIN调控胶质瘤细胞生长的研究

LncRNA IRAIN调控胶质瘤细胞生长的研究

胡圆 冯斯 黄磊 王湘赣 邱兵 张小军

宜春市人民医院      336000

【摘要】 目的 探讨LncRNA IRAIN对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响。方法 通过实时定量PCR(qRT-PCR)检测胶质瘤细胞株U251和U87中LncRNA IRAIN的表达情况；qRT-PCR检测转染病毒前后LncRNA IRAIN1在细胞中的表达水平,荧光显微镜和流式细胞仪测转染效率。运用CCK-8法检测细胞的增殖能力、transwell和划痕实验检测细胞的侵袭能力。结果：LncRNA IRAIN在胶质瘤细胞中高表达, 低表达LncRNA IRAIN可以抑制胶质瘤细胞株U251和U87的增殖及侵袭能力。结论 LncRNA IRAIN1通过影响胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力来调控胶质瘤细胞生长。

【关键词】LncRNA IRAIN; 胶质瘤; 增殖; 侵袭

神经胶质瘤是最常见的原发颅内恶性肿瘤,具有高发病率,高复发率,高死亡率和低治愈率等特点。尽管包括外科手术,放疗和化疗在内的治疗方法均被运用于治疗神经胶质瘤患者,患者预后仍不理想,中位生存期只有15个月左右[1]。近几年的研究证明了除了编码基因以外,非编码基因在胶质瘤的生长,发展过程中同样起着重要的调控作用,影响胶质瘤细胞的生长,增殖,侵袭,凋亡和血管生成[2; 3; 4]。目前相对于小分子短链非编码RNA (microRNA)而言,长链非编码RNA分子(lncRNA)研究较少[5; 6] 。

LncRNA IRAIN是LncRNA家族中的一员, 其核苷酸长度为5359nt,位于染色体15q26.3[7]。通过查询相关文献,我们发现LncRNA IRAIN在胰腺癌、非小细胞肺癌、急性白血病和乳腺癌均参与肿瘤的生长作用[8；9]。LncRNA IRAIN通过参与IGFR/IGF-1和VEGFA/MMP2信号通路的调控来产生作用[10]。目前，暂未发现LncRNA IRAIN在胶质瘤细胞生长,发展过程中所起作用的相关报道。这为我们提供了一个新的研究方向与思路,本实验通过研究LncRNA IRAIN对胶质瘤细胞增殖和侵袭的影响来探讨神经胶质瘤的潜在分子治疗靶点,为临床治疗胶质瘤提供理论基础和指导思想。

材料与方法

1.细胞培养

胶质瘤细胞株U87,U251购自中科院上海细胞库.胶质瘤细胞株U87和U251在添加10％胎牛血清的DMEM培养液中培养,培养箱设置条件为37℃、5％CO2。

2. 细胞转染

载有LncRNA IRAIN基因片段的病毒载体购自上海吉玛公司.在转染前一天将1×105个胶质瘤细胞株（U87或U251）接种在6孔板内,24小时后用病毒增强液转染,病毒滴度(MOI)分别为10和100.转染后24小时移去含有病毒增强液的混合液,加入含10%FBS的培养基,重新置入37℃、5％CO2温箱培养.72小时后通过荧光显微镜和流式细胞仪检测转染效率。

3.胶质瘤细胞株中LncRNA IRAIN表达情况

用Trizol法分别提取转染前后的胶质瘤细胞株的总RNA，逆转录成cDNA。分别用LncRNA IRAIN和GAPDH引物于荧光定量PCR仪进行Real-time PCR扩增，以GAPDH作参照。按照试剂盒说明书，扩增体系为20ul，2×All-in-One qPCMix 10ul，miRNA qPCR Primer 2ul，Universal Adaptor PCR Primer 2ul，cDNA 2ul，50×ROX Referenc Dye 0.4ul，ddH2O3.6ul。反应条件：95 ℃预变性10min，95 ℃变性10sec，63℃退火20sec，72℃延伸20sec，反应40个循环，溶解曲线温度范围：65℃～95 ℃。Real-time PCR结果判定：△Ct=CT目的基因一CT内参(GAPDH)，△△CT=△CT治疗,组一△CT对照组，RQ(Relative Quantitation)治疗组=2-△△CT，RQ对照组=1[8]。通过SPSS version 13.0,t检验和单因素方差分析来分析所得数据。

4.细胞增殖

将转染后的胶质瘤细胞（U251或U87）按2×103个/100ul接种到96孔板中，分别在接种后6h、12h、24h、48h、72h向每孔中加入10ulCCK-8溶液，37℃条件下再培养4h，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度并计数各组肿瘤细胞增殖率。

5. 细胞侵袭和迁移

用无血清培养基6：1稀释Matrigel胶，后匀铺于Transwell小室，每孔40ul，37 ℃反应30min。使Matrigel聚合成胶。将3组转染后24h的胶质瘤细胞以5×104/孔接种于transwell小室，在含5%CO2培养箱中37℃连续培养48h。用湿棉签擦去上层细胞，4%多聚甲醛固定30min，0.1%结晶紫染色1 min，高倍镜下随机取6个视野计数，取平均数。重复三次。将各组细胞按5×10

3个/ml接种到6孔板中, 在含5%CO2培养箱中37℃连续培养12h后,用200ul枪头垂直下划, pbs清洗3次后加入2ml培养基,放入37度5%CO2培养箱培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。

6.统计学分析  应用SPSS 13.0统计软件处理数据，实验数据采用均数±标准差（ x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

结果

1.LncRNA IRAIN在胶质瘤细胞中的表达水平

运用qPCR方法检测胶质瘤细胞U87、U251和对照细胞U27中LncRNA IRAIN的表达水平。研究数据显示,LncRNA IRAIN在U87和U251中的表达水平高于U27中的表达水平。

图1 LncRNA IRAIN在胶质瘤细胞株U87、U251中的表达水平高于U27中的表达水平(*p<0.05;**p<001;***p<0.001)。

2.胶质瘤细胞转染病毒的效率

用载有si-LncRNA IRAIN基因片段的病毒载体转染胶质瘤细胞(U87和U251),荧光显微镜和流式细胞仪检测转染后细胞发现转染效率均大于80%,符合实验要求。进一步运用RT-PCR检测转染前后胶质瘤细胞中LncRNA IRAIN表达水平,实验数据显示在转染载有si-LncRNA IRAIN基因片段病毒的胶质瘤细胞中,LncRNA IRAIN的表达水平明显低于转染空白载体的胶质瘤细胞和未处理的胶质瘤细胞。

图2 a 荧光显微镜下U87和U251转染病毒载体的细胞状态。b U87和U251转染病毒载体的转染效率。c 转染病毒后的U87细胞中的LncRNA IRAIN呈低表达。d 转染病毒后的U251细胞中的LncRNA IRAIN呈低表达(*p<0.05;**p<001;***p<0.001)

3.下调LncRNA IRAIN可抑制胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力

通过CCK8增殖实验检测转染si-LncRNA IRAIN病毒组、空白对照组和阴性对照组的胶质瘤细胞增殖能力。根据数据分析发现,相对于对照组的胶质瘤细胞增殖能力,下调LncRNA IRAIN表达水平可抑制U87和U251的增殖能力。通过Transwell和划痕实验方法检测各组胶质瘤细胞的侵袭和迁移能力。我们发现:低表达LncRNA IRAIN的U87和U251的侵袭能力比其他对照组胶质瘤细胞差。

图3 a 转染病毒前后U87细胞在6h、24h、48h和72h的增殖曲线与统计学分析(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.001);.b 转染病毒前后U251细胞在6h、24h、48h和72h的增殖曲线与统计学分析(*p<0.05,**p<0.005,***p<0.001).c.d 低表达LncRNA IRAIN组的U87和U251细胞侵袭和迁移能力低于阴性对照组和空白对照组的胶质瘤细胞.

讨论

鉴于神经胶质瘤难以根治的特性,基因靶向治疗日渐成为新的研究方向.近几年的研究发现,非编码RNA同样在胶质瘤细胞的生长,发展过程中起调控作用。相对于小分子非编码RNA(<200bp)的研究状况,大分子非编码RNA(>200bp)在胶质瘤细胞中的研究较少[2; 11]。lncRNA在胶质瘤细胞的生长,发展过程中所起的调控作用同样不可忽视。

LncRNA IRAIN是lncRNA家族中的一员。通过本实验研究发现LncRNA IRAIN在胶质瘤细胞株(U87和U251)中的表达水平高于对照细胞,进一步实验研究发现下调LncRNA IRAIN可以抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭能力。基于本实验研究结果, LncRNA IRAIN对胶质瘤细胞生长,发展的调节机制可能为临床治疗胶质瘤提供一种新思路。

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