药用高活性胰酶生产工艺的研究

药用高活性胰酶生产工艺的研究

包前德门

赤峰市云淞科技发展有限责任公司 024000

摘 要

胰酶又称胰液素，是一种常用的医药、工业的原料药，其成本低廉易于获取，且所含活性物质种类丰富，可以作为基础原料从中提取多种生化药品，是多种酶的混合物，如：激肽释放酶、弹性蛋白酶、核糖核酸酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、羧肽酶、胰糜混合酶、脂肪酶、淀粉酶等等。随着科学技术发展对胰酶里蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性要求不断提高，尤其对脂肪酶的活性要求比较高，其中胰蛋白酶水解蛋白质生成蛋白胨及其衍生物，胰淀粉酶水解淀粉生成糊精、麦芽寡糖及麦芽糖，胰脂肪酶水解脂肪生成甘油和脂肪酸等。在中性或弱碱性条件下活性最强，为助消化药物，用于消化不良、食欲不振、胰腺疾病所引起的消化障碍及糖尿病人的消化不良等。

实验结果表明，该工艺制备的胰酶里的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性和收率比较高，蛋白酶活性4500u/mg左右,脂肪酶活性40000u/mg左右，淀粉酶活性80000u/mg左右，收率达17%以上。该工艺操作简便、成本低、重复性好、活性高、收率高。

关键词：胰酶、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶

前 言

高活性药用胰酶是从牛或猪的胰脏中提取得到的一种混合酶制剂，主要含有胰蛋白水解酶类、脂肪酶和淀粉酶。胰脏含有十分丰富的水解和消化酶，体内蛋白质的消化主要靠胰酶。胰酶水解蛋白质所得产物仅三分之一为氨基酸，其余与寡肽[1]。胰蛋白酶刚从胰脏分泌时，是以没活性的酶原形式存在，经肠激酶和氯化钙的作用下才能变有活性的酶。胰蛋白酶水解蛋白质变成蛋白胨及衍生物，胰淀粉酶是一种淀粉a-1,4-糊精酶，它水解淀粉的限度为30%~90%，主要作用于淀粉的a-1,4-糖苷键，生成糊精、麦芽寡糖和麦芽糖。胰脂肪酶是水解脂肪分子中甘油酯键生成甘油和脂肪酸[2]。药用胰酶是否具有胰脏中按天然比例的酶特性，生产工艺而定。

化学组成和性质：胰酶是从动物胰脏中提取的一种酶的混合酶，呈白色或淡黄色无定形粉末，有特殊的肉臭味，有吸湿性，部分溶于水及低浓度的乙醇溶液中，不溶于高浓度乙醇、丙酮和乙醚等有机溶剂中。水溶液在酸性时（PH2~3）稳定，PH6以上时不稳定，氯化钙可增加其稳定性，遇酸、热、鞣酸及重金属时蛋白质产生沉淀。胰蛋白酶最适PH值为8.0-9.0，胰脂肪酶最适PH值为7.0，胰淀粉酶最适PH值为6.9，用胰酶作水解剂时，PH值控制在7-9为宜。胰酶在体内最适温度为37℃，在体外当水解剂使用时一般采用45-50℃为宜[3]。

原辅材料:新鲜冷冻胰脏，十二指肠，氯化钙，新丙酮，

设备及工具：绞肉机，胶体磨，一级分离机，二级分离机，240目布袋，压榨机，离心机，制粒机，烘干机，粉碎机，温度计，比轻计，不锈钢桶，尼龙棒

分析仪器：紫外可见分光光度计，分析天平，烧杯，容量瓶，干燥箱，超声波清洗仪，恒温水浴锅，精密恒温酶测定仪

以猪胰脏为原料用丙酮的提取工艺：

工艺设计： 胰酶生产工艺流程图及环境区域划分

工艺流程：

冻胰脏  解冻 绞肉肉糜  水、丙酮胰浆激活、自溶    一次分离    加丙酮                                       

胰乳  二次分离    沉淀 吊滤、压榨      粗制胰酶  脱脂、干燥  胰酶成品

工艺过程：

1、解冻：如果胰脏是冻品，需在室温解冻数小时,解冻非常关键，影响活性和收率[4]。

2、绞肉、磨浆：绞肉不宜太粗，磨浆温度控制低温。

3、提取、激活：提取胰脏重量的0.5倍水,20%回收丙酮，6%十二指肠，0.2%氯化钙，温度控制10℃-15℃为佳，搅拌两小时，自溶激活20小时左右。整个过程最好是恒温，保证活性和收率稳定。

4、沉淀：加0.83左右的回收冷丙酮。超过0.85的回收丙酮，适当加大丙酮量，使丙酮浓度达到0.900-0.895控制。

5、吊滤：用240目布袋吊滤，丙酮淋差不多了，进行压榨，加快丙酮的渗出。

6、压榨：尽量压干，后期好脱脂、脱水。压榨次数看滤饼的干湿情况而定，泡冷新丙酮里进行脱脂，室温放置一夜，隔天进行二次压榨，在跑一次冷新丙酮了进行脱脂，2-4小时为宜。

7、离心、制粒：脱脂、脱水最后离心，离心机电机防爆的，用14目的摇摆制粒机制粒，上烘干机进行干燥。

8、干燥：温度不宜过高，控制在55℃左右，如果真空干燥的情况下温度可以逐渐升至60℃左右，烘干时间控制好，胰酶活性对温度很敏感。

9、成品：微生物有要求，后期的离心、制粒、烘干需在D级洁净环境下进行。

10、活性：蛋白酶4600u/g，脂肪酶41000u/g，淀粉酶85000u/g。

11、收率：收率能达到17%，最高能达到20%以上。

12、丙酮的回收：丙酮回收塔进行回收，丙酮浓度控制在0.82左右，回收率90%以上。

检测活性：

1、蛋白酶

对照品溶液   精密称取酪氨酸0.0501g加0.2mol/L盐酸溶液至100ml容量瓶中，并稀释至刻度。

供试品溶液  取本品各0.1025g,0.1027g,精密称定，置乳钵中，加冷至5℃以下的氯化钙溶液少量，研磨均匀，置100ml量瓶中，加氯化钙溶液至刻度，摇匀；精密量取1ml置50ml量瓶中，加入冷至5℃以下硼酸盐缓冲液至刻度，摇匀。

酪蛋白溶液  称取酪蛋白1.5g，加0.1mol氢氧化钠溶液13ml与加水40ml，在60℃水浴中溶解后，放冷，用水稀释至100ml，调节PH值至8.0 即得。

检验方法

取试管6支，分别精密量取供试品原液1ml与硼酸盐缓冲液2.0ml，在40℃水浴中保温10分钟，分别精密加入在40℃水浴中保温的酪蛋白溶液5ml，摇匀，立即置于40℃±0.5℃水浴中准确反应分钟，再各精密加入5%三氯醋酸溶液5ml终止反应，混匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；精密量取供试品原液1ml，加硼酸盐缓冲液2.0ml，在40℃±0.5℃水浴中保温10分钟，精密加5%三氯醋酸溶液5 ml，摇匀，置40℃±0.5℃水浴中准确反应30分钟，立即精密加入酪蛋白溶液5ml，摇匀，滤过，取续滤液作空白对照；照分光光度法，在275nm波长处，测定并计算供试品溶液的吸收度的平均值（A）。供试品溶液测得的A值应在0.15～0.6，否则应调整浓度，另行测定。

另用0.2mol/l盐酸溶液作空白对照，在275nm的波长处测定对照品的吸收度（As）。按下式计算[5]。

每1g胰蛋白酶活力（单位）=

质量标准：按干燥品计算，每1g中含胰蛋白酶活力不得少于600单位。

2、淀粉酶   

供试品溶液：取本品各0.3014g,0.3009g,精密称定，置乳钵中，加冷至5℃以下的磷酸盐缓冲溶液少量，研磨均匀，置200ml量瓶中，加磷酸盐缓冲液稀释至刻度，摇匀。

测定方法

取1%可溶性淀粉溶液25ml、磷酸盐缓冲液10ml、1.2%氯化钠溶液1ml与水20ml，置250ml碘瓶中，在40℃水浴中保温10分钟，精密加入供试品溶液1ml，摇匀，立即置40℃±0.5℃水浴中准确反应10分钟，加1mlo/L盐酸溶液2ml终止反应，摇匀，放至室温后，精密加碘滴定液（批号/有效期                 ）（0.05mol/L）10ml，边振摇边滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液45ml，在暗处放置20分钟，加硫酸（1→4）4 ml，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）滴定至无色。另量取1%可溶性淀粉溶液25ml、磷酸盐缓冲液10ml、1.2%氯化钠溶液1ml与水20ml，置碘瓶中，在40℃±0.5℃水浴中保温10分钟，放至室温后，加1mlo/L盐酸溶液2m，摇匀，加入供试品溶液1ml，摇匀，精密加碘滴定液（0.05mol/L）10ml，边振摇边滴加0.1mol/L氢氧化钠溶液45ml，在暗处放置20分钟，加硫酸（1→4）4 ml，用硫代硫酸钠滴定液（0.1mol/L）的硫代硫酸钠滴定液应为2.0～4.0ml，否则应调整浓度，另行测定。

每1g含胰淀粉酶活力（单位）=

质量标准：按干燥品计算，每1g中含胰淀粉酶活力不得少于7000单位。

3、脂肪酶

取样品精密称定，0.1026g ，0.1030g，置乳钵中，加冷至5℃以下的三羟甲基氨基甲烷缓冲液少量，研磨均匀，置100ml量瓶中，加三羟甲基氨基甲烷缓冲液稀释至刻度，摇匀。

测定方法

量取橄榄油乳液25ml、牛胆盐溶液2ml与水10ml，置100ml烧杯中，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）调节pH值至9.0，在37℃±0.1℃水浴中保温10分钟，再调节pH值至9.0。精密量取供试品溶液1ml，在37℃±0.1℃水浴中准确反应10分钟，同时用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定使反应液的pH值恒定在9.0，记录消耗氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）的量。另取在水浴中煮沸15～30分钟的上述供试品溶液1ml，照上述方法测定作空白对照。

每1g含有胰脂肪酶活力（单位）=

式中：A为供试品消耗氢氧化钠滴定液的容积，ml。

B为空白消耗氢氧化钠滴定液的容积，ml；

M为氢氧化钠滴下液的浓度，mol/L； 

W为供试品取样量，g；   n为供试品稀释倍数

质量标准：按干燥品计算，每1g中含胰脂肪酶活力不得少于4000单位。

4、微生物限度 取本品，照非无菌产品微生物限度检查：

1g供试品中需氧菌总数不得过10000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，不得检出大肠埃希菌。10g供试品中不得检出沙门菌。

讨论：综上所述，高活性胰酶的提取生产取决于从原料、辅料的采集开始严格把控，遵守工艺规程和操作规程，符合条件的硬件、软件和高素质的操作人员才能生产出达标的产品，高质量的产品用途更广泛、价值更高。

1、原料处理：采集胰要在4h内送入冷库，于-18℃以下冷冻，若立即投料不用冷冻，冷藏就可以。胰脏先刨片再绞肉，有助于胰酶提取。

2、酶原激活：温度和PH值至关重要，温度控制在10℃-15℃，温度低可适当延长激活时间，温度高适当缩短时间。弱酸性条件下加钙离子和十二指肠，效率高激活充分。

3、提取溶剂的选择：一般采用丙酮提取，也可采用乙醇和异丙醇，用乙醇提取脂肪酶失活比较严重，后期脱水困难。异丙醇提取收率低，回收温度高，能源消耗较高。

4、稳定高活性：控制好生产每个环节，过去认为好产品是检验和生产出来的，而现在引入“质量源于设计”的概念。不仅要有现代厂房和先进设备的硬件基础和文件、管理的软件保障，更要有实施、操作的高素质人员，才能保证高质量、低成本、造精品。

5、微生物：蛋白酶容易变味、发霉，生产过程的控制及及时清洁很关键，污染微生物影响活性和收率，所以清洁环节要认真控制。

参考文献：

1、王玉田.动物性副产品加工利用[M].化学工业出版社,2009.

2、李良铸.现代生化药物生产关键技术[M].化学工业出版社,2006.

3、袁勤生,赵健.酶与酶工程[M].华东理工大学出版社,2005.

4、王春艳,孙美华.药品生产质量管理规范[M].化学工业出版社,2020.

5、郭勇.酶的生产与应用[J].化学工业出版社, 2003.

作者简介：包前德门 1984.07.16 男 内蒙古通辽市 蒙古族 在职研究生 化工工程，中级 赤峰市云淞科技发展有限责任公司 研究方向:蛋白酶的生产与应用