无菌生产工艺中无菌管路连接设备接管性能的确认及研究

无菌生产工艺中无菌管路连接设备接管性能的确认及研究

张颖聪1 周敬明2  范恭铭1 鲁兴旺2   魏君言1

兰州生物制品研究所有限责任公司质量保证部 730046  兰州生物制品研究所有限责任公司疫苗一室 730046

【摘要】 目的 为了降低疫苗无菌生产工艺中热塑管连接过程产生的无菌风险，通常采用无菌接管设备进行热塑管无菌连接操作。无菌接管机目前广泛应用于生物制品行业中细胞规模化培养，原液纯化及除菌过滤过程中热塑管连接，本次验证通过对无菌管路连接设备接管性能的确认和研究，以保证管路无菌连接过程的可靠性；方法通过对两种存放温度下（常温储存和﹣20℃冷冻储存）的管路进行无菌接管效果压力挑战及密封性确认、无菌接管后管路内不溶性微粒检测、无菌接管后管路内微生物挑战试验等，确认无菌接管设备接管后热塑管的有效性及管路内的无菌性；结果常两种存放温度下（常温储存和﹣20℃冷冻储存）的热塑管分别接管后，其接口处均可耐受1.5bar的压力且密封性良好；两种管路内不溶性微粒检测结果均满足《中华人民共和国药典》2020版三部中对注射用水的指导要求；无菌接管后两种管路内微生物挑战试验后管路中的培养基浊度检测值与阴性对照管中的培养基浊度检测值基本一致，与阳性对照管路中的培养基浊度值有明显区别。结论 本次试验中无菌接管机的性能可满足验证方案的预期要求，可以应用于疫苗无菌生产工艺中热塑管的无菌连接过程。在疫苗无菌生产工艺中对热塑管进行无菌接管操作时，应严格按照要求对无菌接管设备进行维护保养和定期确认，同时重点关注热塑管的密封性和刀片的清洁情况、使用次数，在证设备性能始终保持良好状态的前提下，有效降低热塑管连接过程无菌风险，实现管路无菌连接的目的。

【关键词】热塑管无菌连接；压力挑战；密封性确认；不溶性微粒检测；微生物挑战试验。

【Abstract】Objective To reduce the sterility risk arising from the thermoplastic tube connection process in the vaccine aseptic production process, the thermoplastic tube aseptic connection operation is usually performed with aseptic nozzle equipment. At present, an aseptic nozzle is generally used in the biological products industry in the process of cell scale culture, stock solution purification and sterilization filtration of thermoplastic pipe connection. This verification was through the confirmation and research on the performance of aseptic pipe connection equipment to ensure the reliability of the aseptic pipe connection process; Methods  The effectiveness of the thermoplastic tube and the sterility of the tube were confirmed through the pressure challenge and sealing confirmation of the pipe under two storage temperatures (normal temperature storage and -20℃freezing storage), the insoluble particles in the pipe after the sterile pipe were detected, and the microbial challenge test in the pipe after the sterile pipe was conducted. ResultsAfter the thermoplastic tubes are respectively connected at two storage temperatures (normal temperature storage and -20℃frozen storage), the joints can withstand the pressure of 1.5 bar and have good sealing performance. The results of the two kinds of insoluble particles in the pipeline meet the requirements of the third part of the 2020 edition of the Pharmacopoeia of the People's Republic of China on the guidance of water for injection; After the microbial challenge test in the two kinds of tubes, the turbidity values of the medium in the tubes were the same as those in the negative control tubes, and the turbidity values of the medium in the positive control tubes were different.

ConclusionThe performance of the aseptic nozzle in this experiment can meet the expected requirements of the verification scheme, and can be implemented to the aseptic connection process of thermoplastic tube in the vaccine aseptic production process. In the aseptic operation of the thermoplastic tube in the vaccine aseptic production process, the aseptic tube equipment should be maintained and regularly confirmed in strict accordance with the requirements, while focusing on the sealing of the thermoplastic tube, the cleanliness of the blade and the frequency of use, to effectively reduce the aseptic risk during the thermoplastic tube connection on the premise that the performance of the equipment is always in good condition. Achieve the purpose of the aseptic connection of the pipeline.

【Key words】Thermoplastic tube aseptic connection; Pressure challenge; Confirmation of tightness; Detection of insoluble particles; Microbial challenge test.

为了降低疫苗无菌生产工艺中热塑管连接过程产生的无菌风险，可采用无菌接管设备进行热塑管无菌连接操作。无菌接管机目前广泛应用于生物制品生产阶段细胞规模化培养、原液纯化及除菌过滤等过程中管路之间的无菌连接。连接操作时需要在无菌接管机中插入管件支架、一次性刀片及热塑管，并通过触摸屏启动连接工艺：仪器先将刀片加热（410℃）以去除热原，然后冷却至焊接温度，该温度由红外传感器控制。接着刀片剪切管件后，管件支架自动旋转，并建立新的连接。

由于无菌接管机所连接的热塑管品牌、管径大小等的不同因素，以及无菌保证（SAL）、接管一致性、接管过程中焊接处的耐压能力等方面的影响，使用前需要对无菌接管机的接管性能进行确认和研究，主要的确认项目如下：（1）无菌接管效果压力挑战及密封性确认；（2）无菌接管后管路内不溶性微粒检测（3）无菌接管后管路内微生物挑战试验。

1材料与方法

1.1主要设备

无菌接管机：赛多利斯牌，型号为BioWelder® TC；无菌封管机：赛多利斯牌，型号为BioWelder® TC，主要用于试验辅助封管；脉动真空高压灭菌柜：新华牌，型号SGL-R；洁净工作台：苏净牌，型号SW-CJ-2FD；激光尘埃粒子计数器：MetOne3400型；压力校验仪：Fluke牌，型号 718，用于管路接管后压力检测；Themo便携式浊度仪：型号AQ500，用于培养基浊度检测。

1.2 主要材料  管路：本试验中选用的热塑管为疫苗生产时较常用的品牌和尺寸（见表一）；胰酪大豆胨液体培养基（TSB）：由兰州生物制品有限责任公司自制，批号为20230607；灭菌注射用水：由兰州生物制品有限责任公司自制，批号为20230601；微生物挑战试验用指示微生物：铜绿假单胞菌〔 CMCC (B)10104 〕/ATCC。

1.3试验用热塑管的制备  疫苗无菌生产工艺中管路连接过程中使用的管路通常在室温下保存，但有些工艺也会经过低温保存后进行管路连接操作，因此本次试验选取常温（18℃-26℃保存）和低温（﹣20℃）冷冻后的两种热塑管分别进行试验，每个试验进行三次，每根试验管路的长度为30CM，本次试验共使用38根试验管路。管路具体信息见表1。

表1 试验中使用的热塑管信息

1.4微生物挑战试验用菌液制备

参照《中华人民共和国药典》2020版三部微生物检查法、药品GMP指南的方法对试验菌种进行培养，将传代适宜的（不超过5代）、铜绿假单胞菌的新鲜培养物用0.9%无菌氯化钠溶液进行10倍系列稀释，制成每ml含菌落数小于100cfu的菌悬液，待用。应注意，在室温下放置的菌悬液需要在2小时内使用，若保存于2~8℃可在24小时内使用。

微生物挑战试验前，将足够预留的培养基倒入一只足以放置6根管路的不锈钢容器中，在容器中接种铜绿假单胞菌菌悬液，置于30~35℃培养48小时，当培养基出现混浊时进行取样，用比浊法检测菌液浓度，当菌液为浓度＞106cfu/ml的浓菌液时，可用于微生物挑战试验。

1.5试验用管路灭菌及存放

将38根试验管路按存放温度分别打包，将两包试验管路经脉动真空高压灭菌器灭菌处理（121℃，30min），灭菌后，将常温存放的管路不拆包放置在洁净区内的洁净工作台中，将低温保存的管路不拆包放置在洁净区内的﹣20℃冷库中，分别存放48小时后，待用。

1.6无菌接管效果压力挑战及密封性确认

1.6.1使用无菌接管机分别将PR-A-1、PR-B-1、PR-A-2、PR-B-2、PR-A-3、PR-B-3、PL-A-1、PL-B-1、PL-A-2、PL-B-2、PL-A-3、PL-B-3按照表一中的配对方式两两连接，组成六组管路：PR-AB-1、PR-AB-2、PR-AB-3、PL-AB-1、PL-AB-2、PL-AB-3。

1.6.2使用无菌封管机分别对上述六组管路的一端进行密封。

1.6.3密封好后，依次在每根管路的开口端接入压缩空气，调节压缩空气压力至1.5bar以上保持，观察管路接口处的是否有开裂的现象。

1.6.4确认管路接口处完整后，继续保持压力并将其放入水中浸泡10分钟，观察管路接口处是否有气泡产生并记录。

1.7无菌接管后管路内不溶性微粒检测

1.7.1在洁净工作台内使用无菌接管机分别将WR-A-1、WR-B-1、WR-A-2、WR-B-2、WR-A-3、WR-B-3、WL-A-1、WL-B-1、WL-A-2、WL-B-2、WL-A-3、WL-B-3按照表一中的配对方式两两连接，组成六组管路：WR-AB-1、WR-AB-2、WR-AB-3、WR-AB-1、WR-AB-2、WR-AB-3。

1.7.2使用无菌封管机分别对上述六组管路的一端进行密封，用无菌移液器将灭菌注射用水注进管路中，再使用无菌封管机封堵管路另一端，放置48小时。

1.7.3用灭菌后的刀片划破管路取样，进行不溶性微粒检测，记录检测结果。

1.8 无菌接管后管路内微生物挑战试验

1.8.1在洁净工作台中使用无菌接管机分别将MR-A-1、MR-B-1、MR-A-2、MR-B-2、MR-A-3、MR-B-3、ML-A-1、ML-B-1、ML-A-2、ML-B-2、ML-A-3、ML-B-3按照表一中的配对方式两两连接，组成六组管路：MR-AB-1、MR-AB-2、MR-AB-3、ML-AB-1、ML-AB-2、ML-AB-3，阴性对照管为单独一根，不需要进行连接操作。

1.8.2使用无菌封管机分别对上述六组管路及阴性对照管路、阳性对照管路的一端进行密封。

1.8.3将TSB注进管路中，使用无菌封管机封住六组管路及阴性对照管路另一端。

1.8.4用注射器将配制好的菌液加入阳性对照管的培养基中，接种量0.1ml（＜100CFU/ml），使用无菌封管机封住阳性对照管的另一端。

1.8.5将两端封口、充满培养基的八根管路放置于30℃~35℃孵箱培养3天。

1.8.6将培养后的六组管路同时放置于高浓度的铜绿假单胞菌菌液（大于106  CFU/mL）中浸泡48h，阴性对照管、阳性对照管放置于洁净工作台内48h。

1.8.7浸侵结束后，将六组管路取出，用消毒剂消毒后将外表面擦拭干净，然后将来回翻转，确保管路内表面跟培养基完全接触。

1.8.8将处理好的六组管路连同阴性对照管、阳性对照管一起放置在30-35℃孵箱培养7天。

1.8.9取出培养完成的管路，逐个目检观察管内是否混浊长菌，随后用灭菌后的刀片划破管路进行取样，进行浊度检测。

2结果

2.1无菌接管效果压力挑战及密封性确认结果  分别将连接好的六根管路中通入1.5bar以上的压缩空气，六根管路内的压力分别为：1.5238bar、1.5272bar、1.5312bar、1.5139bar、1.5263bar、1.5331bar，经观察加压后六根管路接口处均未出现开裂、破损现象。将加压管路分别放置于水中浸泡10分钟以上，经观察六根管路接口均未出现气泡，表明管路接口处密封性良好。（见表2）

表2 无菌接管效果压力挑战及密封性确认结果汇总

2.2无菌接管后管路内注射用水不溶性微粒检测结果  分别对六根管路内放置48h的注射用水进行取样检测，对管路内灭菌注射用水进行检测，所有样品均符合《中华人民共和国药典》2020版三部0903不溶性微粒检查法中对注射用水的指导要求：含10µm及10µm以上的不溶性微粒数应在20粒以下，含25µm及25µm以上的不溶性微粒数应在5粒以下。（见表3）

表3 无菌接管后管路内注射用水不溶性微粒检测结果汇总

2.3无菌接管后管路微生物挑战试验结果  分别对培养完成的六根试验管路及阴性对照管路、阳性对照管路中的培养基进行取样检测，各管路的检测结果分别是：MR-AB-1（3.8NTU）、MR-AB-2（3.8NTU）、MR-AB-3（3.8NTU）、              ML-AB-1（3.8NTU）、ML-AB-2（3.8NTU）、ML-AB-3（3.8NTU）、阴性对照（3.8NTU）、阳性对照（213.7NTU）。试验结果表明：阳性对照管路中的培养基能够支持铜绿假单胞菌生长，在此前提下，六根试验管路中的培养基浊度与阴性对照管路中的培养基浊度检测值相近，六根试验管路中没有被指示微生物（铜绿假单胞菌）侵染的现象，接管后的六根试验管路完整性符合无菌要求。

表4 无菌接管后管路内微生物挑战试验结果汇总

2.4  综合判定

无菌生产工艺中不同温度存放条件下，无菌管路连接设备接管性能的符合要求。

3讨论

无菌药品生产过程中降低微生物污染风险是疫苗生产企业实施GMP管理的核心内容，在疫苗无菌生产过程中使用无菌接管设备进行接管操作，是降低管路连接无菌风险的有效手段之一。无菌接管机的接管性能是决定热塑管连接效果的主要因素。结合企业质量管理水平的不断提高，本研究参照《中华人民共和国药典》2020版三部、药品GMP指南中的方法和指导要求，通过对两种存放温度下（常温储存和﹣20℃冷冻储存）的热塑管进行无菌接管效果压力挑战及密封性确认、无菌接管后管路内注射用水不溶性微粒检测、无菌接管后管路内微生物挑战等试验，确认不同温度条件下储存后的热塑管经无菌接管设备接管后管路的有效性及管路内的无菌性均符合无菌生产要求，为疫苗无菌生产过程中无菌接管操作的有效性和适用性提供了依据。

疫苗无菌生产过程中无菌接管操作是生物制品生产工艺中的关键一环。无菌接管设备具有适用范围广、焊接管路质量高、操作简单快速等特点，适用于疫苗无菌生产过程中的空管或充满液体管路的无菌接管操作。在日常无菌生产操作中，应严格按照要求对无菌接管设备进行维护保养和定期确认，应当重点关注连接后热塑管的密封性和耐压性，必要的情况下，建议定期对其进行确认和验证，同时还应关注无菌接管设备的刀片清洁情况及使用次数，建议刀片为一次性使用，以防止反复使用刀片或刀片清洁不到位导致的污染风险增加。

在保证无菌接管设备接管性能始终保持良好状态的前提下，使用无菌接管设备进行无菌接管操作能有效降低热塑管连接过程污染的风险，更好的实现无菌接管的目的。

利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献

[1]国家食品药品监督管理局. 药品生产质量管理规范（ 2 0 1 0 年修订)附录 1 无菌药品[EB/OL]. [2011-02-24]. http:// www.sda.gov.cn/gg201116/fl1.rar.

[2]国家食品药品监督管理局药品认证管理中心.药品GMP指南.无菌药品[M].1版,北京:中国医药科技出版社2011:270-283.

[3]《中华人民共和国药典》2020版三部0903不溶性微粒检查法.北京:中国医药科技出版社,2020.05 ISBN 978-7-5214-1575-9.

[4]兰州生物制品研究所有限责任公司. MS-48-QC-01新培养基模拟灌封促生长试验及微生物挑战试验SOP[R].兰州:兰州生物制品研究所有限责任公司,VO2 .

[5]《中国药典》2020版四部“无菌检查法(通则1101)”.北京:中国医药科技出版社,2020.05 ISBN 978-7-5214-1575-9.

[6]〈USP 1207〉 PACKAGE INTEGRITY EVALUATION-STERILE PRODUCTS[M].2014.12

ISBN 9787122174796

[7]〈USP 1207.1>PACKAGE INTEGRITY TESTING IN THE PRODUCT LIFE CYCLE-TEST METHOD SELECTION AND VALIDATION[M].2014.12 ISBN 9787122174796

[8]〈USP 1207.2〉PACKAGE INTEGRITY LEAK TEST TECHNOLOGIES[M].2014.12 ISBN 9787122174796

[9] ASTM D6653/D6653M-13Standard Test Methods for Determining the Effects of High Altitude on Packaging Systems by Vacuum Method[S].2013:19428-2959.