液相色谱质谱联用法测定铁皮石斛中黄曲霉毒素含量

液相色谱质谱联用法测定铁皮石斛中黄曲霉毒素含量

杨文婉，黄志强，张婷

绵阳市疾病预防控制中心理化检验所

摘要： 目的 建立液相色谱质谱联用法（liquid chromatograph-mass spectrometer，LC-MS）测定铁皮石斛中黄曲霉毒素含量的方法。方法实验以0.2％甲酸溶液和乙腈作为流动相， 柱温 40 ℃。样品经振荡超声离心提取， 过0.22μm滤膜，加入同位素内标溶液后上样。 采用电喷雾离子源ElectronSpray Ionization，ESI），多反应监测（Multiple Reaction Monitoring，MRM）模式检测，内标法定量。结果 该方法的标准曲线线性良好，相关系数r为0.9992～0.9996，检出限为 0.0001mg/kg，回收率在94.5%~112.8%之间，相对标准偏差（RelativeSandard Deviation,RSD）值为3.96%~9.25%。结论 该方法快速、简便、灵敏、准确，适宜于铁皮石斛中黄曲霉毒素的快速测定。

关键词： 液相质谱联用法（LC-MS）；铁皮石斛；黄曲霉毒素；方法

Determination of aflatoxin content in Dendrobium officinale by liquid chromatography-mass spectrometry

YANG Wenwan,HUANG Zhiqiang,ZHANG Ting

ThecenterforDiseaseControlandPreventionofMianyangcity,Sichuan ,621000,China

Abstract:Objective To establish a liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) method for the determination of aflatoxin content in Dendrobium officinale. .Methods 0.2% formic acid solution and acetonitrile were used as the mobile phase for gradient elution.Column temperature  was 40℃.The sample was extracted by oscillating ultrasonic centrifugation and passed through 0.22μm filter membrane,add isotopic internal standard solution and sample.Multi response monitoring (MRM) of Electron Spray Ionization (ESI) for quantitative determination . Quantified by internal standard method(ISTD).Results  The correlation coefficients were 0.9992～0.9996 ,their detection limit were 0.0001mg/kg,their recovery rate was between 94.5%~112.8% and Relative Sandard Deviation(RSD) value was 3.96%~9.25%.Conclusion This method was rapid,simple,sensitive and accurate,and it was a sutiable method for rapid determination of  aflatoxin in Dendrobium officinale.

Keywords: Liquid chromatograph-mass spectrometer(LC-MS);Dendrobium; Aflatoxin ;Method

黄曲霉毒素（aflatoxins，AFs）是由黄曲霉（As‑pergillus flavus）和寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）等霉菌产生的一类结构相似的双呋喃香豆素衍生物【1】。目前已发现约20种黄曲霉毒素衍生物，其中包括AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1等。其中AFB1具有最强的毒性，是致癌物质中的一级致癌物【2-3】。食用AFB1含量超标的食物或饲料会对肝脏造成损害，甚至导致肝癌。当AFB1浓度超过10μmol/L时，会加速细胞氧化，导致DNA损伤、染色体异常分裂和细胞凋亡【4】。AFB1在体内代谢为AFB1

-8,9-环氧化物后，会与肝细胞的DNA结合，从而导致肝癌【5】。根据《中国药典》（2020版），铁皮石斛是兰科植物铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）的干燥茎，在云南、浙江等地区一直被作为食品原料使用。它的用途主要包括鲜食、烹饪、榨汁、泡茶以及传统的泡酒等。据大量研究表明，铁皮石斛富含生物碱、多糖、氨基酸、微量元素等成分【6-7】。随着国家卫生健康委员会和国家市场监督管理总局将铁皮石斛正式纳入按照传统既是食品又是中药材的物质目录，铁皮石斛在中药保健领域必将得到更多的应用和发展。

我国目前还没有统一的铁皮石斛中黄曲霉毒素的安全限量规定。因此，研究铁皮石斛中黄曲霉毒素的检测方法对于制定铁皮石斛中黄曲霉毒素残留安全限量标准具有现实意义。黄曲霉毒素检测的方法有薄层色谱法、酶联免疫测定法、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法等。薄层色谱法操作简单、费用低廉，主要用于初步筛选；酶联免疫测定法测定速度快、成本低，适用于大量样品的集中检测；胶体金免疫层析法操作方便、迅速，适合现场或少量样品的即时检测。高效液相色谱法具有重现性好，准确度高的优点。液相色谱质谱联用法则可以实现对多组分同时检测，从而解决了色谱分离不完全和假阳性的问题。目前还没有特定的方法来检测铁皮石斛中的黄曲霉毒素。本方法的前处理简单，使用超高效液相色谱串联质谱法可以快速测定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的含量。可作为技术参考，用于快速检测大量铁皮石斛中的黄曲霉毒素残留。

1材料与方法

1.1材料与试剂乙腈中黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2混标（坛墨质检，编号：80060c，浓度：10μg/mL）；乙腈中U-[13C17]-黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2混标（坛墨质检，编号：81169p，浓度：0.5μg/mL）；乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司）；甲酸（成都市科龙化工试剂厂）。本方法所有试剂均为分析纯或以上规格。

1.2仪器与设备液相色谱串联质谱（SCIEX 5500）；电子天平（SHIMADZU UX220H）；低温高速离心机（蜀科TCL-21）；水浴恒温震荡器（上海汗诺仪器有限公司SHA-B）；超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司KH5200B）；超纯水机（Milli-Q IQ7500）；快速开盖高速粉碎机（大德药机DFY-800D）。

1.3实验方法

1.3.1标准储备液 取乙腈中黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2混标0.50ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，即得黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2混合标准储备液，质量浓度为 0.5μg/ml。

1.3.2混合同位素内标工作液 取乙腈中U-[13C17]-黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2混标 0.20ml于10ml 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，即得混合同位素内标工作液，质量浓度为 0.01μg/ml。

1.3.3混合标准工作液 取黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2标准储备液0.20ml于10ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀，即得黄曲霉毒素B1，B2，G1和G2混合标准工作液，质量浓度为 10ng/ml。

1.3.4标准曲线 取6 个10ml容量瓶，分别加入混合标准工作液 0.05ml 、0.10ml 、0.20ml、0.50ml、1.00ml、2.00ml，加20%乙腈-水定容至刻度，摇匀，质量浓度分别为0.05ng/ml、0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、2.0ng/ml。分别准确移取 20μL 同位素内标混合溶液于各内插管中，加入 180μL对应的混合标准曲线浓度点溶液，于涡旋混合器上混合均匀，配制成混合标准曲线溶液系列。

1.3.5色谱条件 液相色谱柱（ACQUITY UPLC® BEH C18，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温40℃ ；流速：0.3mL/min；进样量：10μL ；流动相：A：0.2%甲酸 B：乙腈。梯度洗脱，洗脱程序如表 1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.6质谱条件 离子源参数：正离子模式：ESI离子源参数：离子化电压：5500V；气帘气：32psi；温度：500℃；喷雾气：45psi；辅助加热气：50psi。其他质谱参数见表2。

表2 质谱条件

注：“＊”代表定量离子。

1.3.7样品处理

1.3.7.1样品前处理 准确称取2克（精确至0.01克）试样于50毫升的离心管中。加入20毫升的乙腈-水-甲酸混合液（体积比为70:29:1）。使用涡旋混合器混合1分钟，确保试样与提取溶剂充分混合。将离心管在旋转摇床上振荡30分钟后，超声提取30分钟，增加黄曲霉毒素的提取效率。从提取液中取1.0毫升，转移到另一个1.5毫升的离心管中。以每分钟10000转的速度离心1分钟。将0.5毫升上清液准确转移至另一个1.5毫升离心管中，加入1.0毫升的水，涡旋混合后，在4℃下以每分钟10000转的速度离心5分钟，再次分离出上清液。使用0.22微米的滤膜过滤上清液。吸取180微升处理好的样品滤液，加入到250微升的内插管中。再加入20微升同位素混合内标溶液，涡旋混合，使样品和内标充分混合。待上机进样，进行后续的检测分析。

1.3.7.2加标回收率和精密度 取同一批铁皮石斛约 2.0 g，加入高、中、低三个浓度混合标准溶液，每个浓度进行 6次平行操作，按方法制备供试品溶液，按仪器方法进样分析，计算AFB1、AFB2、AFG1、AFG2 的平均加样回收率以及回收率RSD。

2 结果

2.1 线性关系 由低到高浓度依次进样检测，以各化合物色谱峰与相对应内标色谱峰的峰面积比值-浓度作图，得到内标法-标准曲线回归方程。列出回归方程，相关系数r，见表3。

表3 回归方程结果

2.2加标回收率和 RSD 回收率实验结果表明，添加不同浓度的黄曲霉毒素，回收率在 94.5%~112.8% 之间，RSD值为3.96%~9.25%。结果见表4。

表4 加标回收率和RSD

2.3方法检出限 在本实验条件下，在空白样品中添加标准溶液进行测定，以质谱 3 倍信噪比计算目标组分的检出限为 0.0001mg/kg，其定性定量离子丰度比均在欧盟标准规定的偏差范围内。

3 讨论

   提取方法优化：本研究考察了超声、涡旋提取、震荡提取对黄曲霉毒素提取回收率的影响，最终采取乙腈-水-甲酸(70+29+1体积比)溶液涡旋震荡加超声离心提取方式。若在添加提取液之后，进行旋涡震荡和离心过滤后上样，不同浓度的加标样测得的结果差异不大。这可能是因为铁皮石斛纤维的含量较高，导致其吸水率较高，震荡离心过程无法完全提取到铁皮石斛中的黄曲霉毒素。而通过加入超声提取步骤，可以使加标样的回收率达到94.5%~112.8%，符合实验要求。

本研究提出了一种用于测定铁皮石斛中的黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2含量的新方法。该法具有操作简便、检测成本低、回收率高等优点，适用于高纤维基质中黄曲霉毒素的检测。同时，该方法可为铁皮石斛中黄曲霉毒素残留的调查与防控工作提供技术支持。

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通信作者：杨文婉，E-mail：mzwenwan@qq.com