寻常型银屑病患者外周血线粒体DNA检测及其临床意义

寻常型银屑病患者外周血线粒体DNA检测及其临床意义

苏婧 孙君儒

青海省红十字医院 青海西宁 810000

摘要：目的：对寻常型银屑病患者外周血线粒体DNA检测及其临床意义进行探讨。方法：选取2022年9月至2023年9月期间本院接收的寻常型银屑病患者20例及同时期健康人群20例，采用实施荧光定量PCR检测血浆mtDNA表达。同时，通过体外培养外周血，采用荧光定量 PCR技术，对环形GMP-AMP合酶（cGAS）及 STING 的 mRNA进行测定。外周血中 mtDNA与单核细胞进行体外共培养， ELISA法测定上清液中的白介素23、1-17和干扰素- Y含量。结果：与健康组比较，银屑病患者外周血 mtDNA水平明显增高，其银屑病皮损面积和严重程度指数评分呈正相关。与健康组比较，银屑病患者外周血 cGAS及 STING基因的 mRNA水平明显升高（P<0.001）。PBMC中II-23,L-17,FN-y的表达明显升高（P<0.001)，与 PASI得分成正比（r=0.647.085.0.492, P<0.01）。结论：银屑病病人外周血中， mDNA水平明显增高，其作用机制可能是 cGAS/STING活化免疫信号通路导致，进而达到参与银屑病发生发展的过程。

关键词：寻常型银屑病；外周血线粒体；DNA检测；临床意义

引言：

寻常型银屑病是一类由自身免疫性疾病引起的慢性炎性疾病，发病机制以树突状细胞、中性粒细胞、肥大细胞之间复杂的相互作为为主要变化原因。文献报道，IFN是一种在银屑病发生发展过程中起到关键作用，线粒体 DNA （mtDNA）可由损伤或凋亡的细胞分泌，经cGMP-AMP合成酶（cGAS）介导的炎性因子（STING），如 IFN的分泌，从而加剧无菌性炎症[1]。然而，目前国内外尚无关于银屑病病人外周血中 mtDNA和单个核细胞cGAS-STING的表达和功能的研究。基于此，本研究选取部分寻常型银屑病患者外周血线粒体DNA检测及临床意义进行分析。详细研究内容如下。

一、资料与方法

1.1一般资料

选取2022年9月至2023年9月期间本院接收的寻常型银屑病患者20例及同时期健康人群20例，两组患者平均年龄为（46.09±12.52）岁。所选患者均符合本次研究要求，且P＞0.05，无统计学意义。

1.2方法

1.样本采集

采用真空肝素钠采集10mL空腹静脉血，3mL于600 xg （4℃）下进行10min的离心处理，吸取上层血浆，放入无 RNase管中保存至-80℃冷冻保存，以进行 mtDNA的定量分析。将剩余的7 ml外周血与单核细胞混合，经250 xg离心20分钟后，进行单核细胞的 cGAS、 STINGmRNA的表达及与 tDNA的共培养。

2.定时定量PCR检测外周血mDNA表达

抽取患者的血液200ul，采用 QIAmp DNA微型试剂盒提取其DNA。选用线粒体细胞色素C氧化酶1定量mtDNA，正5’CCCCCATGGCGTTT-3’，反向5’-GTTCAACCTGTTCCTGCTCC-3'。采用18 SrDNA检测。18 SrDNA引物：正向5’-TAGAGGGACAGTGGCGTTC3’，反向5’-CGCTGAGCCAGTCAGTGT-3'。PCR反应系统：将2wL2xSYBR Green Master Mix 、1 umol/L正向、反向引物各1 μL3 μL H20和5 μ 血浆提取的 DNA。采用下列的热循环试验条件：95℃温育2分钟，40个循环，95℃30s,54℃45s,68 ℃1min。PCR采用AB7500PCR法。mtDNA拷贝数与核 DNA拷贝数的比值确定为tDNA的相表达。

3.定时定量PCR检测在单核细胞中的 cGAS及STINGmRNA表达

采用 PrimeSeript试剂盒，从受试者外周血中提取单核细胞并加入1 mL Trizol试剂，逆转 mRNA。在ABI7500定时定量PCR体系中，采用 SYBR PremixExTaq试剂盒对应的 DNA片段进行相应地扩增。cGAS引物：正向5'-GGGAGCTACTATGAGCACGTGAA-3',反向5'ACAAAGTAATATGCACGAGTGTTGG-3';STING物:正向5CACCCTTCTCCCCTTCCTTT-3',反向5'CCTCCTCCTCCTCTCCATTCTT-3'。GAPDH引物:正向5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'.反向5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3'。95℃温育1分钟，35次周期95° C、54° C 45 S、68° C 1分钟。利用2- AACT法，按照内部控制 GAPDH，计算目标基因的相关表达量。

4.mtDNA活化单核细胞

本研究以银屑病病人为研究对象，通过 Ficoll浓度梯度离心法提取外周血中的单核细胞，并加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养液调节其细胞浓度至5x10’/L。

5.ELISA检测

采用 mtDNA与单核细胞共培养，采用 EISA试剂盒测定血清IFN-y,IL-23,L-17的含量，按照试剂说明进行，每次做两次，取其平均值。

1.3统计学方法

本次研究中，使用了SPSS25.0作为数据统计分析工具，计量资料均为正态分布，采用x±s标识，并用t进行检验，对其相关性进行分析。

二、结果

2.1单个核细胞cGAS和STING mRNA水平的比较

研究显示，患有银屑病的患者，cGAS和STING mRNA水平较健康组高，且P＜0.05，见表一。

表一  单个核细胞cGAS和STING mRNA水平的比较

2.2mtDNA与单个核细胞共培养上清液中细胞因子浓度

mtDNA组的IFNγ、IL-23、IL-17水平均高于对照组，且P＜0.05，见表二。

表二  培养上清液中细胞因子浓度

三、结论

免疫系统激活角质形成细胞异常增生是导致银屑病发病的重要原因，该系统主要包括T细胞巨噬细胞和树突状细胞，还伴有IFN-α，IFN-y,IL-12,TNF-α，IL-22,L-23,I-17等[2]。IL-23/IL-17及TNF-α是银屑病发病机制中的关键因子，以其为靶点进行生物学干预可证实以上理论。

mtDNA由线粒体释放到细胞质和细胞外环境中，其发生机制包括组织损伤、细胞应激及细胞凋亡等。近年来，利用基因芯片技术对外伤，急性心肌梗死，败血症，类风湿关节炎，系统性红斑狼疮等病人检测结果显示，其tDNA结果呈高表达状态。本次研究结果显示，银屑病病人外周血 mtDNA含量明显增高，并与病情轻重成正比。

CGAS通过与 tDNA二聚体的形式与其相互作用，使ATP和GTP转化为2’3’-环状 GMPAMP (CGAMP)，从而激活CGAS-STING。cGAMP作为一种重要的信号通路，通过与 STING的相互作用，引起 STING蛋白 C端结构发生改变，募集 TANK蛋白，进而激活下游多个 IFNs相关基因的表达，促进 IFNs的表达[3]。本研究显示， cGASSTING在银屑病病人外周血中表达明显升高。

本研究显示，在银屑病病人中， mtDNA活化后，其外周血单核细胞中IFN-Y、IL-23及IL-17表达均明显升高。临床数据显示，在患者受损皮肤、正常皮肤及血液中，IFN-y均有较高水平的表达，与病情轻重密切相关。研究还显示，IFN-y能促进银屑病发病；此外，我们还发现IFN-y能显著促进银屑病发病过程中多种炎性介质及趋化因子的表达，并伴有CD3+ T淋巴细胞及CD11c等树突状细胞的大量聚集。IFN-y可通过IL-23/IL-17信号通路激活髓系 DC分泌IL-23、I-1B，促进记忆T淋巴细胞I-17分泌。据此推测，IFN-Y通路在该病发生发展过程中起着关键的调控作用。

综上，从上述研究中可以看出，在银屑病病人外周血中，在外周血中， cGAS及 STINGmRNA的表达也明显增高；mtDNA可诱导单核细胞产生大量IFN-y,IL-23,IL-17等分子。tDNA通路在银屑病发病中起着关键的调节作用，而对 mDNA通路的调节将成为治疗银屑病的一个关键靶点。

参考文献：

[1] 马明俊,晁露颖,琚晗宇.血清相关因子水平变化与寻常型银屑病患者PASI评分关系及临床意义[J].中国医疗美容, 2023.

[2] 马今朝,顿耿,于子红,et al.Claudin-1,3在寻常型银屑病患者血清中的表达及临床意义[J].皮肤性病诊疗学杂志, 2023, 30(3):205-210.

[3] 邵勇,衡鲲,代维维,等.寻常型银屑病患者血清miR-138,miR-210表达变化及其与免疫炎症反应的关系[J].山东医药, 2023, 63(25):28-32.