MDCK悬浮细胞驯化之培养基筛选方法

MDCK悬浮细胞驯化之培养基筛选方法

任新颖  王斐  王福慧  张嵘*

辽宁科瑟生物技术有限公司 110000；沈阳药科大学 110016

摘要：目的：驯化传统贴壁培养型MDCK细胞成为悬浮培养型细胞。方法：通过筛选最适宜MDCK细胞悬浮培养的无血清培养基，驯化MDCK悬浮细胞。结果：采用简单直接的驯化方法，驯化MDCK贴壁型细胞进行无血清悬浮培养，驯化周期短，成本低，细胞生长速率快，且细胞生长状态良好。结论：驯化为MDCK悬浮培养型细胞系，为作为细胞介质感染病毒生产疫苗的研究提供了理论支撑。

关键词：MDCK细胞；流行流感；细胞悬浮培养；无血清培养基；

前言：MDCK细胞系是由Madin和Darby从美国马丁•达比犬肾脏远端细胞中分离建立，后经传代培养成永生贴壁上皮细胞[3]。MDCK是用于分离病毒、扩增和纯化的最理想细胞系,被广泛用于流感病毒感染研究，目前也是研究与生产流感疫苗使用最多的介质。

1 材料和方法

1.1 细胞株

实验室所涉及细胞株为贴壁细胞系（美国ATCC，CCL-3）犬肾上皮细胞，批号70040764，viability 94％、VCD 2.4*106cells/mL。采用软琼脂实验法筛选获得克隆性率最低的MDCK细胞。

1.2 试剂

细胞贴壁培养培养基：MEM基础培养基干粉（批号：2641712），购于美国Gibco公司，依照说明采用超纯水配制后用0.22 μm真空过滤器过滤除菌，并分装为500 mL/瓶，置于4 ℃冰箱保存；使用时加入20％或10％胎牛血清（FBS,Fetal Bovine Serum）；MDCK 626培养基（GORNING）；MDCK SFM培养基（批号：YF220802），购于天信和（苏州）生物科技有限公司；MDCK细胞无血清培养基Xeno-S001TM干粉（货号：FG0100403，批号：P220801A0301），购于上海倍谙基生物公司，依照说明采用超纯水配制后用0.22μm真空滤杯过滤除菌分装为1 L/瓶，置于冰箱4 ℃避光保存；胎牛血清（FBS,Fetal Bovine Serum）（批号：202314100）购自太原润生生物公司；0.25％胰蛋白酶（批号：2184134）购于美国Gibco，依照说明用PBS缓冲液配制后用0.22 μm真空滤杯过滤除菌，分装10 mL/管并置于冰箱-20 ℃保存；0.02％EDTA（批号：102491206）自美国Sigma公司购买，用超纯水配制后用0.22 μm真空过滤器过滤除菌，并分装为100 mL/瓶，置于4℃冰箱保存；1％碳酸氢钠（批号：20230708）购自国药集团化学试剂有限公司，用超纯水配制后用0.22 μm真空过滤器过滤除菌，并分装为50 mL/瓶，置于生物安全柜内常温备用；0.4％台盼蓝染色液（货号：LA0519，批号：20230708）自福州飞净生物科技有限公司购入，使用时稀释为2倍。

1.3 设备与耗材

生物安全柜，来自青岛海尔生物医疗股份有限公司，型号：HR30-IA2；二氧化碳培养箱，来自山东博科科学仪器有限公司，型号：QP-160；倒置生物显微镜，来自庆光电技术有限公司，型号：DSZ2000X；细胞荧光计数仪，来自上海睿钰生物科技有限公司，型号：Counistar Mira FL；低速台式离心机，来自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，型号：TDZ-WS；二氧化碳恒温摇床，来自苏州捷美电子有限公司，型号：IS-5C5；细胞培养瓶，来自康宁生命科学(吴江)有限公司，规格：T25、T75；细胞三角培养摇瓶，康宁生命科学(吴江)有限公司，规格：125 mL、250 mL、500 mL、1000 mL；无菌移液管，来自比克曼生物公司，规格：1 mL、5 mL、10 mL；无菌离心管，规格：10 mL。

1.4MDCK细胞无血清培养液培养驯化

复苏3支单克隆实验筛选出的MDCK细胞（F-11），用MEM培养液（20％FBS）培养，第二天更换新MEM培养液（10％FBS），贴壁培养传代至T75规格细胞培养瓶，3瓶细胞数生长至单层90％，弃掉培养液，胰蛋白酶液消化（10％EDTA，1％NAHCO3），MEM培养液终止消化后离心（1600 rpm/min，10 min），分别用MDCK SFM培养液、MDCK 626培养液与MDCK细胞无血清培养液3种非含血清的培养液重悬，直接转移至125 mL规格三角细胞培养摇瓶中，此三瓶分别标注为F11-A、F11-B、F11-C瓶，后用此3种非含血清培养基进行悬浮驯化培养。二氧化碳恒温摇床中培养3天，离心（1600 rpm/min，10 min）重悬，传代至250 mL规格三角细胞培养摇瓶中，后采用同种悬浮培养驯化方法，分别依次传代至规格500 mL、1000 mL三角细胞培养摇瓶中。每间隔1 d（Day）从摇瓶中各自取样台盼蓝染色后细胞计数。

1.5 台盼蓝染色细胞计数法

将稀释的台盼蓝染色液与细胞悬液1:1混合均匀，转移至细胞计数板，细胞计数仪下检测，得活细胞数、总细胞数、活率、直径、接团率等数据。

2 结果

2.1 MDCK细胞无血清培养液培养驯化

MDCK悬浮驯化期间，培养时间每间隔1 d，对使用3种不同类型非含血清培养基的摇瓶取样计数，最终得出图2生长曲线图。比较可知，相比于MDCK SFM培养基与SFM 626培养基，选用MDCK细胞无血清悬浮培养基进行悬浮培养驯化，细胞生长速率最快，VCD最高达1.14×107 cells/mL，细胞活率最高，viability最高达98％，由图1可知驯化后的悬浮培养型MDCK细胞呈大小均匀、透亮的圆形，生长状态好，直径约18.29 μm。

3 讨论

本研究是利用“筛选无血清培养基”的直接驯化法，筛选出适宜悬浮型MDCK细胞悬浮培养生长的培养基，即MDCK无血清悬浮培养基（倍谙基），逐步扩大摇瓶规格继续传代培养，使MDCK细胞最终适应悬浮培养[9]，将贴壁培养型细胞系驯化为无血清悬浮培养型细胞株MDCKS-F11，最终将新型悬浮培养型细胞株冻存。

以悬浮培养型MDCKS细胞为介质研究流感疫苗目前仍是最受欢迎的工艺方法[10]，此工艺规模易放大，经济价值较高，对流感疫苗实际工业化生产具有重大意义。

参考文献：

[1] 冯磊,吴培培,褚轩,等.MDCK单细胞悬浮生长的驯化筛选及其在AIV增殖上的初步应用[J].浙江农业学报, 2015, 27(6):8.DOI:10.3969/j.issn.1004-1524.2015.06.03.

[2] 陈宏,杨柳,宋海岩,et al.悬浮MDCK细胞的驯化与H5亚型禽流感病毒的培养[J].中国农业科学, 2018.DOI:CNKI:SUN:ZNYK.0.2018-17-015.

作者简介：第一作者 任新颖 2001.04.06 女 河北邯郸 汉族 硕士 沈阳药科大学 研究方向:流感病毒疫苗

第二作者 王斐 1963年1月24日 男 吉林省长春市 汉 本科 高级医学生物学工程师 辽宁科瑟生物技术有限公司 研究方向:生物制品及疫苗

第三作者 王福慧 1999年1月23日 女 黑龙江省哈尔滨市 汉 硕士研究生 辽宁药科大学 研究方向:生物学

通讯作者 张嵘 女 辽宁省沈阳市 汉