葛根提取物的急性毒性、遗传毒性和亚慢性毒性研究

葛根提取物的急性毒性、遗传毒性和亚慢性毒性研究

陈琦 彭芳

山东药品食品职业学院 山东 威海 264210

摘要：目的 研究葛根提取物的急性毒性、遗传毒性及亚慢性毒性，为葛根提取物开发利用提供科学数据。方法 依据食品安全国家标准，对葛根提取物进行急性经口毒性试验、三项遗传毒性试验和90d经口毒性试验。结果 小鼠急性经口LD50＞12.0g/(kg·bw)，属实际无毒级；三项遗传毒性试验结果均为阴性；大鼠90d经口毒性实验中，各剂量组动物生长发育良好，体重、增重、进食量、食物利用率、血液学、血生化、尿常规、脏器湿重及脏/体比等指标与阴性对照组比较均无显著性差异(P＞0.05)，组织病理学观察未见与试验因素有关的变化，确定该葛根提取物最大未观察到有害作用剂量(NOAEL)为4.00g/(kg·bw)（相当于人体推荐剂量的300倍）。结论 在本次条件下，葛根提取物未见急性毒性、遗传毒性及亚慢性毒性。

关键词：葛根提取物；急毒；遗传；90g喂养

葛根素是从中药野葛中提取的单一成分，具有扩张冠状动脉、降压、抗心肌缺血、改善微循环[[1]][[2]]、调节血脂代谢、清除自由基[[3]][[4]]等作用，具有广阔大市场应用前景。现依照食品安全国家标准要求，进行急性经口毒性试验、遗传毒性试验和大鼠90d经口毒性试验等毒理学试验，为其开发利用提供基础毒理学资料。

1 材料和方法

1.1 实验材料

本研究均使用SPF级动物。90 d经口毒性试验：SD大鼠80只雌雄各半，体重63～85 g，急性经口毒性试验：ICR小鼠20只雌雄各半，体重18.1～22.0g，均来源于济南朋悦实验动物繁育有限公司[SCXK(鲁)2019-0003]；哺乳动物红细胞微核试验：ICR小鼠50只雌雄各半，体重25.0～35.0g，均来源于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006]。

1.2 主要试剂与仪器

葛根提取物（经10倍量50%乙醇80℃提取2h、8倍量50%乙醇80℃提取2h，过滤、浓缩、干燥等工艺制成，得率约10%，葛根素含量达到15.0%），推荐日用量0.8g。

T1000型电子天平、T2000型电子天平、JJ100型电子天平、JA2003N电子天平、离心机、OLYMPUS显微镜、日立7100型全自动生化分析仪、SIEMENS ADVIA 2120i血液分析仪、Stago STA-Compact全自动血凝仪、长春迪瑞H-300尿液分析仪。

1.3 实验方法

1.3.1 急性经口毒性试验

按照限量法试验进行。受试物最大灌胃浓度为100 mg/mL，按0.4 mL/10 g体重(bw)，一日内3次进行经口灌胃(ig)，每次间隔4h，合并一次剂量为12.0 g/(kg·bw)，观察动物一般表现并记录，持续14d。

1.3.2 细菌回复突变试验

考虑受试物对菌株的毒性和溶解度，最高剂量设置为每皿5 mg，按等比组距原则下设4 个剂量组(每皿8、40、200、1000 μg)和4个对照组(自发回变、溶剂对照、DMSO对照组和阳性对照组)。分别在加/不加S9条件下用平板掺入法进行两次试验。

1.3.3 哺乳动物红细胞微核试验

受试物最大灌胃浓度为100 mg/mL，按0.2 mL/(kg·bw)灌胃，高剂量组为2.0 g/(kg·bw)，按2 倍组距下设2个剂量组[即1.0、0.5g/(kg·bw)]。另设纯化水组和环磷酰胺组(40mg/(kg·bw))。受试物按0.2mL/10(g·bw)间隔24 h两次ig给予。第二次ig后6h采集胸骨骨髓，制片。每只动物至少观察200个红细胞(RBC)，同时计数嗜多染红细胞(PCE)在总红细胞中的比例。每只动物至少观察2000个PCE，计数有微核的PCE频率。

1.3.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验

按GB 15193.23食品安全国家标准 体外哺乳类细胞染色体畸变试验要求，选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择2500、1250、625μg/mL3个剂量组。另设溶剂对照组、阳性对照组，在无代谢活性条件下，采用直接至突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活性条件下，采用间接至突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为15μg/mL。

1.3.5 90d经口毒性试验

(1)剂量选择与受试物给予方式

受试样品人体推荐剂量为0.8g/人/日（体重60kg计），设4.00g/kg·bw/d、1.33g/kg·bw/d、0.44g/kg·bw/d三个剂量组（高、中、低），分别相当于人体推荐剂量的300倍、100倍、33倍。另设一个空白对照为0g/kg。取受试样品直接掺入饲料，按逐级稀释的方法掺入基础饲料中喂饲大鼠，受试样品掺入饲料时，90天经口毒性试验大鼠每日摄食量按体重8%折算，高、中、低剂量组受试样品掺入基础饲料的百分含量分别为5.00%、1.67%、0.55%。空白对照组喂饲基础饲料。各组大鼠给予各剂量饲料，连续喂养90天。动物自由进食饮水。

(2)方法

各组动物给予各剂量组饲料连续喂养90天后，隔夜禁食，逐只称重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经腹主动脉取血测其血液学指标和血液生化指标。

1.4 统计学方法

统计学处理用SPSS 22.0软件进行分析，数据用±s表示。计量资料用方差分析、计数资料用卡方检验和Poisson分布进行组间比较，以P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著性差异。

2 结果

2.1 急性经口毒性试验

各组小鼠饮水进食正常，未见中毒症状，体重逐日增加，14d内无死亡。结果显示雌雄小鼠的LD50均大于12.0g/(kg·bw)，属实际无毒级。

2.2 细菌回复突变试验

两次试验中受试物各剂量组回变菌落数均未大于自发回变菌落数的2倍，亦无剂量-反应关系，说明在加与不加S9时该受试物对五株试验菌株均未呈现遗传毒性。

2.3 哺乳动物红细胞微核试验

与阴性对照组比较，葛根提取物各剂量组对雌雄小鼠的含微核细胞率无统计学意义(P＞0.05)，结果为阴性。

2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验

在无代谢活化处理3小时条件下，受试样品各剂量组的细胞染色体畸变率均低于5%，与溶剂对照组相比，各剂量组未发生染色体畸变率显著增加（P＞0.05）。阳性对照组（丝裂霉素）染色体结构畸变率为24.0%，与溶剂对照组相比在统计学上具有显著增加（P＜0.05）。在代谢活性条件下，受试样品各剂量组未发生细胞染色体畸变率显著增加（P＞0.05）。阳性对照组（环磷酰胺）染色体结构畸变率为22.0%，与溶剂对照组相比在统计学上具有显著增加（P＜0.05）。桑叶提取物体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果为阴性。

2.5 90d经口毒性试验

2.5.1 动物的一般观察

各组动物一般表现和行为均未见明显异常、无中毒表现、无死亡。

2.5.2 对大鼠体重、食物利用率的影响

与阴性对照组比较，葛根提取物各剂量组的每周体重、进食量、食物利用率和体重增重、总进食量、总食物利用率均无统计学意义(P＞0.05)。

2.5.3 眼部检查

在试验前和试验结束时，对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化。

2.5.4 血液学测定结果

各剂量组的各指标与0g/kg·bw/d组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

表1 葛根提取物对大鼠血液学指标的影响（n=10）(±s)

表1续 葛根提取物对大鼠血液学指标的影响（n=10）(±s)

注：白细胞计数WBS、红细胞计数RBC、血红蛋白HCB、红细胞压积HCT、血小板计数PLT、淋巴细胞LYM、中性粒细胞NEU、单核细胞MON、嗜酸细胞EOS、嗜碱细胞BASO、凝血酶原时间PT、活化部分凝血酶原时间APTT

2.5.5 血液生化学测定结果

各剂量组的各指标与0g/kg·bw/d组比较，差异均无统计学意义(P＞ 0.05)。

表2 葛根提取物对大鼠血液生化学指标的影响（n=10）(±s)

表2续 葛根提取物对大鼠血液生化学指标的影响（n=10）(±s)

注：丙氨酸氨基转移酶ALT、门冬氨酸氨基转移酶AST、总蛋白TP、白蛋白ALB、碱性磷酸酶ALP、谷氨酰转肽酶GGT、血糖GLU、尿素BUN、肌酐CR、总胆固醇CHO、甘油三酯TG、钾离子、钠离子、氯离子

2.5.6 尿液检查结果

经口给予大鼠不同剂量的葛根提取物90天，测定各剂量组大鼠尿液外观、比重、尿蛋白、pH、葡萄糖、潜血。比重、pH值、尿蛋白、尿葡萄糖、尿潜血均采用等级秩和进行统计处理。大鼠尿液外观均未见明显异常。

2.5.7 病理解剖

(1)大体解剖

90 d 经口毒性试验结束后，大体观察各剂量组动物的脑、垂体、甲状腺、胸腺、肺、心脏、肝、脾、肾、肾上腺、胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠、直肠、胰腺、肠系膜淋巴结、卵巢、子宫、睾丸、附睾、前列腺和膀胱等组织器官均未见明显异常。

(2)组织病理学检查

对照组和高剂量组之间的组织病理学改变发生率和严重程度没有明显差异。未发现与受试样品有关的组织病理学改变。

(3)脏器系数测定结果

试经口给予大鼠不同剂量的葛根提取物90天，测定各组大鼠脑、心脏、胸腺、肾上腺、肝脏、肾脏、脾脏、睾丸、卵巢、附睾、子宫绝对重量及相对重量（脏/体）。各项指标进行方差齐性检验，雌性大鼠肝脏、脾脏绝对重量和脑、肝脏、脾脏、肾脏相对重量不满足方差齐要求，用秩和检验进行统计处理；其它各指标均满足方差齐要求，用单因素方差分析方法中多个试验组与一个对照组间均数的两两比较方法进行统计处理。各剂量组的各指标与0g/kg·bw/d组比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。

3.总结

综合以上结果，在本次条件下，本次所研究的葛根提取物属于实际无毒级物质，未见遗传毒性效应，90d经口毒性试验未观察到有害作用剂量。

引用文献：

[[1]] 吴清，陶宏凯，等.葛根素对大鼠缺血再灌注心肌细胞保护作用的研究[J].中国现代中西医药杂志.2004,2（9）：772-774.

[[2]] 王永霞，何立人.葛根素的心血管系统药理作用及机理研究[J].上海中医药杂志.2004,38（4）：62-64.

[[3]] 秦文，董兴兵，等.葛根素的临床应用新进展[J].中国药业.2004,13（7）：75-76.

[[4]] 朱庆磊，何爱霞，吕欣然.葛根素对氧自由基的清除和抗氧化性损伤作用[J].解放军药学学报.2001,17（1）：1-3,13.