孟鲁司特通过免疫细胞抑制过敏性哮喘的研究

孟鲁司特通过免疫细胞抑制过敏性哮喘的研究

秦继全,张尊善 ,顾启龙 ,姚舜宇 ,景秀丽*

山东第一医科大学(山东省医学科学院)  化学与制药工程学院 山东 泰安 271016

 摘要：孟鲁司特（Montelukast）可预防哮喘发生，在缓解哮喘症状及脱敏后治疗哮喘等方面均有重要作用，但其能否通过影响免疫细胞，包括T细胞、B细胞、ILC2s、嗜酸性粒细胞、DC、巨噬细胞等进而影响过敏性哮喘的症状发生，研究较少。我们以50μg papain诱导正常C57BL/6小鼠过敏性哮喘为模型，用孟鲁司特腹腔注射小鼠，每天用孟鲁司特处理小鼠以达到维持孟鲁司特持续效果。处理之后 6 天，pbs、papain、papain +Montelukast组进行对比，分别比较各组支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺中各类免疫细胞的数量变化情况。结果：pbs组显示嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量细胞数量较少；papain组显示上述细胞数量都显著增加；而papain +Montelukas与阳性对照papain组相比，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量都显著减少。进一步进行肺组织Q-PCR分析，结果显示，papain +Montelukas与阳性对照papain组相比，肺ILC2s细胞特异性转录因子GATA3、RORα、Bcl11b及其2型效应细胞因子IL-5、IL-13的表达水平显著性下降。结论：在 papain诱导急性过敏性哮喘中，孟鲁司特可能是通过抑制肺ILC2s细胞特异性转录因子表达及其功能，从而减轻炎症，减缓急性过敏性哮喘症状。

关键词：过敏性哮喘；孟鲁司特；免疫细胞

哮喘是以气流阻塞、黏液高分泌、嗜酸粒细胞及肥大细胞浸润气道壁为特征的常见慢性呼吸系统疾病[1]，一般是由花粉、霉菌、尘螨及通过空气传播的刺激物或传染病等过敏原引起的，以反复发作的气道阻塞和喘息为特征。流行病学调查显示，全世界有3亿多人患有哮喘。哮喘被世界医学界公认为四大顽症之一，被列为十大死亡原因之最，影响了接近 3％的人口，并且发病率在过去10年里一直持续增长。

过敏性哮喘过去被认为主要是由Th2细胞介导的炎症反应。近年来的一系列研究表明，II型固有淋巴样细胞（Type 2 Innate Lymphoid Cells , ILC2s） 在过敏性哮喘的发病机制中发挥重要作用[2-6]。孟鲁司特(montelukast)是近年来由默克公司研制开发的一种高选择性半胱氨酰白三烯(Cys—LT)受体拮抗剂。最近研究发现，孟鲁司特可以通过促进支气管舒张和气管平滑肌扩张等作用缓解过敏性性哮喘炎症[7-8]。但孟鲁司特（Montelukast）能否通过影响免疫细胞，包括ILC2s、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等进而影响过敏性哮喘的症状发生，研究较少。我们以木瓜蛋白酶papain诱导正常C57BL/6小鼠过敏性哮喘为模型，研究孟鲁司特对肺ILC2s、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等的影响，以期减少哮喘病人对皮质类固醇的依赖，为炎症性疾病的研究提供新思路，为治疗过敏性哮喘提供新方法。

1.材料和方法

1.1 材料

    正常C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司，孟鲁司特（Montelukast）和木瓜蛋白酶（papain）购自Sigma公司。

1.2 动物免疫和处理

    将18只C57BL/6小鼠随机分为3组，pbs组、papain组、papain +Montelukast组。papain组和papain +Montelukast组用50μg过敏原papain连续滴鼻免疫3天（day0、day1、day2），免疫的同时腹腔注射Montelukast (100mg/kg/天)，诱导正常C57BL/6小鼠急性过敏性哮喘模型。免疫后第6天（day5）处死，分析检测各处理组滴鼻免疫后day5时肺及BALF中炎症性细胞，包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量变化情况；肺组织Q-PCR检测。

1.3 方法

1.3.1 BALF中炎症性细胞变化分析

BALF收集及细胞分类计数。免疫后day5时眼球采血，通过气管插管行支气管肺泡灌洗，分3次缓慢注入PBS液，分别为0.7 mL、0.7 mL和0.6 mL，缓慢收集，回收率约为 80%。收集的细胞溶液，2500 r/min 离心，5min，收集上清液 -20 ℃保存待测。沉淀用 0.2 mL PBS 重悬，并采用血细胞计数板进行白细胞分类计数。取 100 μL 细胞悬液进行离心甩片，晾干后进行 Diff-Quik染色，光学显微镜下进行细胞分类计数，数200个细胞，求出各类白细胞百分比，进而计算出各类白细胞的细胞数目。

1.3.2 肺组织中炎症性细胞变化分析

     颈椎脱臼处死小鼠，制备肺组织细胞单细胞悬液，细胞沉淀用 0. 4 mL PBS 重悬，并用血细胞计数板进行细胞分类计数。取 100 μL

细胞悬液进行离心甩片，室温晾干后进行 Diff - Quik染色，光学显微镜下进行细胞分类计数 ，求数200个细胞，求出各类白细胞百分比，进而计算出各类白细胞的细胞数目。

1.3.3 肺组织Q-PCR检测

用组织总RNA提取试剂盒（天根，DP431）提取各处理组织总RNA，用反转录试剂盒（天根，KR103-04 ）将各处理组总RNA进行反转录成cDNA。采用荧光定量PCR试剂-天根SYBR Green（FP205）在实时荧光定量PCR仪（赛默飞，ABI7500）对各不同基因GATA3、RORα、Bcl11b、IL-5、IL-13 表达水平检测。

1.3.4 统计分析

     每组 3 只或 3 只以上小鼠，实验独立重复 3 次以上。使用GraphPad Prism6.0 软件。使用独立样本t检验分析数据， *表示 P<0.05，**表示 P<0.01，***表示 P<0.005，****表示 P<0.0001。

2.结果

2.1 孟鲁司特对BALF中炎症性细胞的影响。

图1. 各组小鼠 BALF中炎症性细胞分类计数的比较

     孟鲁司特干预组（papain +Montelukast组）小鼠BALF嗜酸性粒细胞、中性粒细胞数目与阳性对照哮喘组（papain组）相比都显著性下降，差异均有统计学意义 （均Ｐ＜0.005）; papain +Montelukast组与正常对照组相（pbs组）比， 嗜酸性粒细胞显著性增加，具有统计学意义 （Ｐ＜0.01）；而中性粒细胞数目无明显差异，见图 1。

2.2 孟鲁司特对肺组织中炎症性细胞的影响。

      图2. 各组小鼠肺组织中炎症性细胞分类计数的比较

     对肺组织中炎症性细胞进一步观察，发现与BALF中相类似的结果， 孟鲁司特干预组（papain +Montelukast组）小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞细胞数目与阳性对照哮喘组（papain组）相比也都显著性下降，差异均有统计学意义 （均Ｐ＜0.005）；但与正常对照组（pbs组）相比，嗜酸性粒细胞数目变化无明显差异，而中性粒细胞数目显著性增加，具有统计学意义 （均Ｐ＜0.05），见图 2。

 2.3 孟鲁司特对肺组织中ILC2s的影响。

图3. 各组小鼠肺组织中 GATA3、RORα、Bcl11b、IL-5、IL-13表达水平检测

进一步研究孟鲁司特对肺组织中ILC2s的影响发现， 孟鲁司特干预组（papain +Montelukast组）小鼠肺组织中ILC2s的特异性转录因子 GATA3、RORα、Bcl11b及其主要功能相关的2型效应细胞因子IL-5、IL-13的表达水平与阳性对照哮喘组（papain组）相比都显著性下降，差异均有统计学意义 （均Ｐ＜0.005）；与正常对照组（pbs组）相比，小鼠肺组织中ILC2s的特异性转录因子 GATA3、RORα及其主要功能相关的2型效应细胞因子IL-5、IL-13的表达水平显著性增加（均Ｐ＜0.05），但Bcl11b表达水平显著无明显差异，见图 3。

3.讨论：

人们发现孟鲁司特不仅可以改善哮喘患者的肺功能，而且在抗炎、免疫等诸多方面也有重要的应用价值。但孟鲁司特通过影响哪种免疫细胞的功能，从而影响过敏性哮喘症状尚不清楚。我们的研究结果表明孟鲁司特可能是通过降低肺组织中ILC2s特异性转录因子 GATA3、RORα、Bcl11b及其主要功能相关的2型效应细胞因子IL-5、IL-13的表达水平，进而使肺和支气管灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数目显著性下降，最终缓解过敏性哮喘炎症。

参考文献

[1]P. J. Barnes. Asthma mechanisms[J]. Medicine, 2016, 4P4(5).

[2]Scadding G K, Scadding G W. Innate and Adaptive Immunity: ILC2 and Th2 Cells in Upper and Lower Airway Allergic Diseases [J]. J Allergy Clin Immunol Pract, 2021, 9(5): 1851-1857.

[3]Vivier E,Artis D,Colonna M,Diefenbach A,Di Santo JP,Eberl G,Koyasu S,Locksley RM,McKenzie ANJ,Mebius RE: Innate Lymphoid Cells: 10 Years On. Cell 2018 ,174(5):1054-1066.

[4]van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R: Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. 

Semin Immunopathol2016, 38(4):483-496.

[5]Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K: [Group 2 innate lymphoid cells (ILC2s)]. Arerugi2015, 64(1):46-56.

[6]T. Y. F. Halim，C. A. Steer，L. Math?，M. J. Gold，I. Martinez-Gonzalez，K. M. McNagny，A. N. J. McKenzie，F. Takei. Group 2 Innate Lymphoid Cells Are Critical for the Initiation of Adaptive T Helper 2 Cell-Mediated Allergic Lung Inflammation[J]. Immunity, 2014, 40(3).

[7]程泽君，梁玉清. 孟鲁司特钠对哮喘急性发作期患者免疫调节功能及炎症因子的影响探究[J]. 山西医药杂志, 2015, 44(22): 2646-2648.

秦蔚，赵宇华.布地奈德联合孟鲁司特对小儿咳嗽变异性哮喘血清白介素-8、肿瘤坏死因子-α及转化生长因子β_1水平的影响[J].中国医药导报, 2013, 10(35): 95-97.基金项目:山东省级大学生创新创业训练计划(S202210439010)，山东省自然科学基金项目(ZR2022MH091 )。

作者简介:秦继全，2021级制药工程本科。

*通讯作者:景秀丽，女，副教授，主要从事药物化学及呼吸道黏膜免疫相关研究，E-mail:jingxiuli84@163.com。

[8]