替加环素对鲍曼不动杆菌体外药敏试验方法学评估

替加环素对鲍曼不动杆菌体外药敏试验方法学评估

符小芳，沈威廷（通讯作者），符秋娟

（广东医科大学附属医院，广东 湛江，524001）

摘要：目的：比较不同体外药敏试验方法检测替加环素对鲍曼不动杆菌的药敏结果，并评估改良纸片扩散法能否作为仪器法的补充方法。方法：收集临床分离的鲍曼不动杆菌73株，以微量肉汤稀释法为参考方法，采用美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）判定标准，评估纸片扩散法、改良纸片扩散法和仪器法的药敏结果与参考方法的一致性。结果：改良纸片扩散法的分类一致性最好，其次是仪器法。改良纸片扩散法的各项指标均在可接受范围内。仪器法没有重大误差，但是分类一致率和基本一致性依然较低，不在可接受范围内。纸片扩散法和仪器法的小误差、分类一致性均不在可接受范围内。结论：不同的药敏方法与参考方法存在较大差异，改良纸片扩散法与微量肉汤稀释法药敏结果一致性最好。纸片扩散法、仪器法与微量肉汤稀释法的一致性较差，当药敏结果为中介或耐药时需要复检。改良纸片扩散法可以作为仪器法的一种补充方法，当仪器法出现可疑药敏结果时，可采用改良纸片扩散法进行复检。

关键词：替加环素；鲍曼不动杆菌；微生物敏感性试验

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter Baumannii，aba）作为最常引起院内感染的病原体之一[1]，该菌曾经对大部分临床药物有着极高的敏感性。目前临床常用的药敏试验方法包括微量肉汤稀释法、VITEK仪器法、纸片扩散法等。根据美国临床和实验室标准协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）标准，最常用的参考方法是肉汤稀释法，此方法可以检测出药物的MIC值。肉汤稀释法的操作较繁杂，检测时间跨度较长，使此方法在临床中不作为常规方法。最简便快捷的方法之一是纸片扩散法，该方法在基层医院中最常用。纸片扩散法缩短了检测时间，能够及时为临床提供用药指导。但是由于替加环素稳定性较差，使纸片扩散法的应用受限。研究表明，替加环素的稳定性主要受培养基品牌、配制时间、纸片的保存等因素影响。对于替加环素稳定性差的问题，添加复敏液可以作为恢复替加环素的活性的新方法。复敏液本身不是一种抗菌药物，故复敏液与替加环素结合使用并非是两种药物的联合应用。此研究中复敏液是乙二胺四乙酸。复敏液应用于纸片扩散法，无需另加其他试剂，仅仅在常规试验时在药物纸片上添加一定量的复敏液即可。添加复敏液的纸片扩散法即改良纸片扩散法。随着临床实验室对检测效率的要求越来越高，大多数三甲医院逐渐开始采用VITEK仪进行药敏试验。由于各种方法的药敏结果有较大的不同，而且目前对替加环素药敏试验的研究较少，本研究将参照FDA标准，以微量肉汤稀释法为参考方法，评估纸片扩散法、改良纸片扩散法和VITEK仪器法的药敏结果一致性，并评估改良纸片扩散法是否可以作为一种补充方法，为仪器法的可疑药敏结果提供参考。

1材料与方法 

1.1 菌株来源 

收集2019年9月至12月经Vitek-2 compact全自动细菌鉴定药敏仪明确鉴定为鲍曼不动杆菌并已使用该仪器进行替加环素药敏实验的菌株59株。仪器法的检测结果中，对替加环素敏感的菌株有33株；对替加环素中介的菌株有16株；对替加环素耐药的菌株10株。为了使实验结果更加客观，本研究将重复的样本去除，并从不同的取材部位分离出菌株。-80℃保存菌株，经过2次传代复苏后使用。

1.2 试剂与仪器

替加环素药敏纸片购自英国Oxoid公司；替加环素标准品购自美国辉瑞制药有限公司；血平板培养基及M-H琼脂培养基购自广州迪景微生物科技有限公司；水解酪蛋白（M-H）琼脂粉购自杭州天和微生物试剂有限公司；氯化钠（NaCl）购自天津医药公司化试分公司；Vitek-2 compact全自动细菌鉴定仪及细菌浊度仪均购自法国梅里埃公司；DW-86W420低温冰箱购自Haier公司；Forma Classll，A2生物安全柜购自美国Thermo公司；MIR253恒温箱购自日本SANYO公司。

1.3 药敏试验

1.3.1 VITEK仪器法药敏试验

收集经Vitek-2 compact全自动细菌鉴定药敏仪明确鉴定为鲍曼不动杆菌并同时进行替加环素药敏实验的菌株。按照Vitek-2 compact仪器SOP文件进行操作。从血平板中挑取不少于3个菌落配制0.5麦氏浓度菌悬液，并将0.5麦氏浓度菌悬液转入含0.45%NaCl溶液的一次性试管中，混匀。在15分钟内将混匀的菌液插入药敏卡上机，进行药敏试验。记录59株菌株的药敏结果。将59株菌株按照敏感、中介和耐药结果分开存放于冰箱中，备用。

1.3.2 微量肉汤稀释法药敏试验

将已收集的菌株在血平板中分离出单一菌落。从血平板中挑取不少于3个菌落，与0.45%NaCl溶液调配出0.5麦氏浓度的菌液。最后在15分钟内将菌液与MIC细菌稀释液调配为l×10

6 CFU/mL的稀释菌液。在已准备好的药敏板中添加菌液。整个过程需尽可能减少药敏板的空气接触和光照暴露。添加完菌液后及时放入培养箱培养16~20h。最后观察对照组生长情况。

结果判断：参照FDA标准，替加环素MIC≤2mg/L为敏感“S”，MIC≥8mg/L为耐药“R”，两者之间判为中介“I”。

1.3.3 纸片扩散法与改良纸片扩散法药敏试验

将已收集的菌株在血平板中分离出单一菌落。从血平板中挑取不少于3个菌落，与0.45%NaCl溶液调配出0.5麦氏浓度的菌液。在15分钟内使用无菌拭子蘸取菌液，并涂布于M-H平板。涂布的过程需要保证接种均匀。在15分钟内，使用无菌镊子安置替加环素纸片于平板。整个过程需尽可能减少纸片的空气接触和光照暴露。

并使用同样的步骤完成改良纸片扩散法的操作，最后使用微量移液枪吸取6μL复敏液于纸片上。

添加完纸片后及时将平板放入培养箱培养16~20h。最后观察生长情况，及记录抑菌圈大小。结果判断：参照FDA标准，替加环素抑菌环≥19mm为敏感“S”，抑菌环≤14mm为耐药“R”，两者之间判为中介“I”。

1.4 四种实验方法分析指标

被评估方法与参考方法一致性可分为以下几个指标：分别为基本一致性、分类一致性、非常重大误差、重大误差、小误差[2]。当菌株使用该方法检测最低抑菌浓度与参考方法最低抑菌浓度相差低于或等于1个稀释度时，此类菌株所占的百分比为基本一致性（essential agreement，EA）。当菌株使用该方法与参考方法药敏结果判断为一致时，此类菌株所占的百分比为分类一致性（categorical agreement，CA）。当菌株使用该方法将药敏结果判断为敏感，而参考方法结果为耐药时，也就是“假敏感”，此类菌株所占的比例为非常重大误差（very major error，VME）。当菌株使用该方法将药敏结果判断为耐药，而参考方法结果为敏感时，也就是“假耐药”，此类菌株所占的百分比为重大误差（major error，ME）。当菌株使用该方法将药敏结果判断为耐药或敏感，而参考方法结果为中介时，此类菌株所占的百分比为小误差（minor error，mE）。各项指标可接受的误差范围是：CA与EA≥90%，VME≤1.5%，ME≤3%，mE≤10%。

1.5 统计学分析

数据分析采用WHONET 5.4软件。

2结果

2.1 四种检测方法检测鲍曼不动杆菌对替加环素的药敏结果

从敏感率可见，改良制片扩散法和肉汤稀释法的结果最高。从中介率和耐药率看，仪器法和纸片扩散法的结果偏高。四种方法的药敏结果分布见表1。

表1 四种方法的药敏结果分布（%）

2.2 三种药敏方法的分析指标

以FDA的判定标准，将微量肉汤稀释法作为参考方法。改良纸片扩散法的分类一致性最好。改良纸片扩散法的各项指标均在可接受范围内。VITEK仪器法和纸片扩散法没有重大误差，但是分类一致率和基本一致性依然较低，不在可接受范围内。三种方法检测替加环素耐药表型的分析指标见表2。

表2 三种方法检测替加环素耐药表型的方法学评估（%）

2.3 常规纸片扩散法与改良纸片扩散法的比较

改良纸片扩散法与参考方法的一致性优于常规纸片扩散法。改良纸片扩散法的敏感率、中介率和耐药率与参考方法较为接近，而常规纸片扩散法的敏感率、中介率和耐药率与参考方法差异较大。

3 结论

随着院内感染的患者数量不断上升，鲍曼不动杆菌对替加环素耐药表型的检测需要一个更快捷更简易的方法。从结果中可以看出，三种被评估方法中改良纸片扩散法与微量肉汤稀释法最接近，另外两种被评估方法均有出现较高的中介率和耐药率[3]。在临床中若将敏感的结果判断为中介或耐药，临床医生将会提高用药剂量来治疗患者或者不用该药物。由于药物的副作用，用药剂量的提高可能会加重患者的身体负担。因此，纸片扩散法和仪器法在检测出中介和耐药的结果往往需要微量肉汤稀释法复检。

目前基层医院最常用方法为纸片扩散法。纸片扩散法检测鲍曼不动杆菌对替加环素的耐药表型仍没有良好的判断折点。而且替加环素的稳定性较差，使该方法的应用受限。参照FDA的判断标准，纸片扩散法的分类一致率较低。如果将大量敏感结果误判为中介、耐药，不但给出了错误的临床用药指导，而且也可能使治疗效果不佳。因此，期待通过调整判断折点和恢复药物的活性来优化纸片扩散法。

本实验针对纸片扩散法，设计出一种更准确更简易的方法。从对照组的细菌生长情况来看，复敏液不具有抑菌作用，它并非是另一种抗菌药物。参照FDA对替加环素药敏判断，改良的纸片扩散法与肉汤稀释法的分类一致性较好。从该方法与纸片扩散法的比较中可看出复敏液提高了替加环素的活性，使检测结果与参考方法的一致性大大提升。三种方法中改良纸片扩散法结果最接近微量肉汤稀释法，但是此方法需要测量抑菌圈大小，在临床检测大批量样本时可能会出现人为误差

[4]。

综上，不同药敏方法可能存在不同的结果。改良纸片扩散法与微量肉汤稀释法药敏结果一致性最好。纸片扩散法、仪器法与微量肉汤稀释法的一致性较差，当药敏结果为中介或耐药时需要复检。三种方法中最适合于临床的应该是仪器法，因为仪器法的操作最为简便，而且结果最为直观。仪器法更现代化和自动化，该方法大大减少了认为操作失误。VITEK仪器法的准确性仍有提升空间，在进行替加环素的药敏试验中可能会出现假耐药。因此，经仪器法检测鲍曼不动杆菌对替加环素敏感性时需使用参考方法进行复检。目前认可的参考方法是肉汤稀释法，而改良纸片扩散法的药敏结果与肉汤稀释法较为接近。改良纸片扩散法比肉汤稀释法更方便快捷，因此，可将改良纸片扩散法作为仪器法的补充方法。其次，纸片扩散法和改良纸片扩散法也适用于临床药敏检测。改良纸片扩散法比常规纸片扩散法更适合于替加环素的药敏试验。因此在选择替加环素药敏结果的检测方法时，有条件的医院可选择仪器法作为常规方法，改良纸片扩散法为补充方法。而基层医院可选择改良纸片扩散法作为常规方法。

参考文献

[1]张小江,徐英春,原英,等.替加环素等14种抗菌药物对多重耐药菌的体外抗菌活性研究[J].中国感染与化疗杂志,2009,9(05):365-368.

[2]张冀霞,王占伟,王启,等.替加环素对临床常见多重耐药菌的体外抗菌活性研究[J].中华检验医学杂志,2013,36(4):308-312.

[3]张冀霞,赵春江,刘文云,等.替加环素对鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌体外抗菌活性检测的影响因素和方法学评估[J].中华检验医学杂志,2013,36(7):604-609.

[4]Ni W,Han Y,Zhao J,et al.Tigecycline treatment experience against multidrug-resistant Acinetobacter baumannii infections:a systematic review and meta-analysis[J].Int J Antimicrob Agents,2016,47(2):107-116.