免疫学领域新型荧光免疫反应平台研究

免疫学领域新型荧光免疫反应平台研究

李俊玲,蔡桂林,游少华

珠海迪尔生物工程股份有限公司  广东 珠海 519000

摘要：近年来，免疫诊断领域发展迅速，相关技术和产品不断涌现。免疫诊断领域的快速发展对荧光检测设备提出了更高的要求。目前国内外众多医院已开始在实验室开展免疫诊断技术的临床试验中发现，肿瘤等疾病的诊断主要依赖荧光免疫检查。但是目前荧光免疫平台仍存在一些问题，比如荧光标记物荧光寿命短、荧光信号受外界干扰影响难以监测等。此外，由于多种化学成分对多种荧光分子具有抑制作用，导致了在临床中使用的荧光检测试剂的用量非常大。荧光免疫平台的技术发展为患者提供了新的治疗方案和检测手段。

关键词：荧光免疫；反应平台；微流控载体

一、荧光免疫平台的主要技术

首先，将目标抗体置于一个专门设计的微流控载体上，将其与目标抗体混合，在微流控平台上通过电泳的方式来实现荧光信号的采集，并在微流控平台上对图像进行分析。目前，荧光免疫平台主要采用免疫化学发光的方法来实现目标抗体的识别。由于目标抗体会随着时间而衰减，因此，必须在微流控平台上使用特定的荧光标记物进行标记。其次，采用荧光激发的方法，也就是利用激发标记物与目标抗体之间的相互作用来实现目标抗体的识别。荧光标记物在受到激发后会发出较强的荧光，这是因为荧光分子发生聚合法所致。再次，利用荧光激发的方法对荧光标记物进行荧光信号的检测。由于荧光激发能够刺激靶细胞分泌出更多的生长因子、信号蛋白和信号肽等分子来影响细胞功能障碍和肿瘤细胞生长并引起荧光信号产生。

图1是本实用新型免疫平台实施例的部分结构示意图。

图1免疫平台部分结构示意图

1、微流控载体

微流控载体是基于液体的生物反应器，目前，已经被广泛应用于临床医学领域，包括流式细胞仪、血细胞分析仪、离心机、动物模型、癌症治疗仪等。微流控载体能够将微流体从微流管中抽出，然后从流控微球中释放。在进行免疫平台研究时，需要先将一个抗体滴入微球中，然后根据抗体的特性及数量控制抗体的释放速度并形成一个液滴，然后利用液滴产生的压力将微流控载体压入到微流管柱中。该方法不仅能够快速地实现实验所需的目的蛋白及抗体物质的制备及定量注射制备等任务。而且在操作过程中不需要使用特殊的试剂盒来确保安全卫生。但由于液体压力的存在，在处理过程中容易造成微管中液体的泄露。所以采用超声清洗的方式对微管进行清洗非常有必要。

2、生物反应器

生物反应器的设计原理为将微流体泵入生物反应器中，通过特定的化学体系对微流体中的细胞进行识别，通过释放荧光分子干扰靶细胞合成和分泌荧光分子来减少荧光信号分子在细胞中的累积。在微流控管中控制化学发光、标记和检测技术的使用，使其可以识别不同抗体并进行相应功能的实现。目前，已有许多研究表明通过使用特殊的化学试剂对微流体中细胞的信号进行识别并刺激靶细胞分泌相关的信号分子和刺激靶细胞进行功能检测的方法。另外，在特定化学试剂中加入特定抗体作为诱导靶细胞产生荧光分子的抗原能使靶细胞与标记物产生更多生物活性。这种方法能够快速有效地降低微流体中目标抗体释放水平和提升其响应时间。此外，通过使用荧光标记物来标记和控制微流体中相应抗原的表达从而使细胞产生不同分子水平上的信号分子也被发现能够与不同抗体中靶细胞产生荧光信号。

3、细胞培养基

目前，利用细胞培养基实现的荧光免疫平台在实际应用中的优势主要表现在：可以通过调节微流控载体和细胞培养基的浓度、流速等来调整荧光蛋白在微流控载体上的分布。微流控载体可以通过改变细胞培养基的浓度来调节荧光蛋白在微流体中的分布。另外，与抗体相比，目标因子需要更高浓度的细胞培养才能产生更强的荧光效应。目前，利用细胞培养基进行荧光免疫平台所存在的缺陷主要包括：浓度范围窄、荧光标记物易降解、细胞培养基易降解。由于肿瘤细胞周期延长和细胞毒性强等特点，其特异性降低且不利于在体外进行针对肿瘤细胞特异性检测。而且细胞生长因子等生物标志物可通过调控蛋白质表达方式来影响肿瘤细胞产生荧光信号甚至是死亡。因此细胞培养基对荧光免疫平台的发展具有重要作用。

二、荧光检测系统设计

荧光免疫平台系统是一种以荧光分子为靶、在机体中进行抗原或抗体识别、免疫反应过程中，能在一定范围内显示发光信息的免疫诊断设备。该系统采用了基于多个光电传感器的探测器，采用了基于光动力学理论的设计思想，具有多种探测模式。如检测荧光，利用荧光分子为靶，将不同模式的荧光信号用光电传感器转换为电信号，通过光动力学理论计算出目标荧光信息，再由光电传感器将荧光信息转换成电信号来进行检测分析。

1、光电传感器

光电传感器是将光信号转换成电信号的传感器，在人体成像中主要应用于疾病的早期诊断和药物的快速筛选。荧光免疫平台采用了多个光电传感器，它们共同构成了一个多通道光电复合传感器（光电感测芯片），在一定条件下发光能够转换为电信号和化学信号。如图1所示。其中多通道光电传感器在光学设计中发挥着重要作用，它可以实现多种探测模式。光电传感器主要包括光源、光电倍增管和光增益放大器[5]。光源主要包括紫外 LED (HID）和可见光 LED (UV-LED）两种光源。其中紫外 LED波长仅为30 nm左右，具有更高精度、更低成本；可见光 LED波长较宽，具有更宽的工作频率[6]。

2、单片机

单片机控制系统使用PCC5606SGC01SP，作为系统控制核心。该电路集成有多种外部接口工具，包括 DSP接口工具、I2C接口工具等，能够很好地解决不同硬件接口的连接问题。CLK9C01作为单片机的主控芯片，是一款低功耗的光电传感器仪器。CLK9C01主控芯片能处理两种以上模式的光源输出信号，还能同时处理多个光源输出信号，具有很高的运算速度和强大的软件处理能力，且使用简单方便。

三、荧光免疫平台介绍

荧光免疫平台是以可回收利用的荧光标记物为核心，采用荧光抗原的荧光免疫检测方法，对样品进行荧光免疫检测，通过检测获得的荧光信号来判断样品中是否存在免疫反应异常现象。本文讲述的荧光免疫平台的荧光标记物包括两个荧光探针（或两个混合探针）和一个荧光标记物载体（可拆卸的载体或荧光标记物载体）。荧光标记物载体将不同探针荧光标记物分别嵌入抗原和抗体混合物的固体胶体中，以固定的方式固定住荧光标记物载体并与其上采样孔连接。本文所利用的荧光探针将抗体标记物载体（或可拆卸的载体或荧光标记物载体）与荧光抗原或抗体混合物相结合（或可拆卸的载体或荧光标记物载体）的荧光探针通过微孔实现荧光免疫反应。当加入抗原抗体时发光探针上的荧光标记物会被荧光标记物载体上的微孔吸起而被固定住并且荧光标记物载体产生出不同颜色的荧光。荧光标记物载体通过微孔将不同颜色荧光标记物载体或荧光诊断试剂溶液吸起并与微孔上采样孔连接组成荧光免疫反应平台。

1、荧光免疫平台具有荧光标记物功能，包括可回收利用的可用于检测的荧光抗原和核酸蛋白及抗体及可回收利用的荧光诊断试剂溶液，与现有技术相比能有效提高检测性能以及降低工作强度。

上面谈到的荧光诊断试剂溶液可以通过与检测试剂溶液的混合溶液中生成或提取荧光抗原分子，将其混合物接种到样品上进行荧光免疫检测。其中，荧光仪器可以采用酶标仪或者分光光度计。可回收利用的荧光标记物载体。荧光标志物是指具有特定功能的标记物载体（如抗原位抗原标记物、抗原标记物化合物），用于激发或触发荧光信号。荧光标记物与核酸和蛋白结合后才能形成不同荧光信号。本文所述荧光平台对这些标记物具有快速识别能力，该识别能力可以通过将已检测出的核酸或蛋白的分子与该标记物混合后进行测定，从而快速诊断出人体内是否存在免疫反应异常现象。

2、具有实时荧光免疫检测功能的免疫系统是利用两个或两个以上的荧光标记物为核心，采用抗体辅助分子技术的方法对样品进行血清或其他免疫抗原抗体检测，使血液中产生或发生不同血清抗体所对应的特异性蛋白质信息通过微孔通道得以传递。

3、荧光免疫检测系统不仅能对正常样品及异常情况进行检测，还能将抗原蛋白实时动态地传递到细胞中去并发出荧光信号，使检测系统实时监控。

系统具有与荧光标记物连接模块，当检测试剂溶液接触到标记物时立即产生一种发光信号，同时，检测仪器通过自动控制系统来实时监控检测系统，从而能对检测仪器进行快速检测并报警。同时，检测试剂溶液接触到标记物之后，能立刻产生一种黄色荧光信号，从而实现对人类血液或组织样品中某些不正常现象进行检测或判断，从而对人体各种疾病进行诊断及预测。此外，本文所述系统还能够对体内不同部位的健康细胞进行探测、实时监测并发出不同颜色信号以及提示是否存在疾病。并能够对人类或人体组织样品进行分析处理并通过图像显示系统来判断人体对特定异常情况（例如癌症细胞、白血病、恶性肿瘤等）、疾病程度及其严重程度。

4、荧光免疫平台具有重复使用灵活方便等特点，能够长期使用无需定期清洗。

其中，可回收利用的荧光免疫平台可重复使用，并且不受荧光诊断试剂溶液的干扰，从而保证平台的荧光信号的准确性。荧光诊断试剂溶液的使用方式可以分为自配制型和分配型。使用前用户可将自己配制型荧光诊断试剂溶液稀释至所需浓度，然后将配置好的荧光诊断试剂溶液通过分配型试剂加入荧光标记物进行反应。然后对荧光抗原进行初步筛选，以确定所需抗原试剂。使用时打开分配型试剂溶液包装瓶即可直接使用.

四、结束语

荧光免疫平台是免疫诊断领域的一项重要技术，主要用于快速检测出体内存在的各种病原微生物，其操作简单，检测迅速，且检测成本低。荧光免疫平台可用于肿瘤检测、细菌性传染病检测、感染检测以及其他疾病的检测。近年来，在肿瘤靶向治疗的新策略中发现，肿瘤免疫治疗能够有效提高肿瘤患者免疫治疗效果，且能够改善预后，且不会产生副作用。该免疫平台主要包括：荧光探针模块以及固定平台等组成。根据荧光探针模块组成的不同，可将荧光探针模块分为三种类型：可分别用于荧光标记物荧光寿命、可作为平台标记物使用的荧光标记物、可用于免疫标记物使用的荧光标记物。此外，固定平台由固定螺钉固定球的孔道中。固定球是一种新型固定装置。

参考文献：

[1]时间分辨荧光分析技术在食品污染物检测中的应用进展[J].孙坤秀，胡志刚，成玉梁，于航，谢云飞，姚卫蓉，郭亚辉，钱和.食品研究与开发.2021(13)

[2]时间分辨荧光在免疫分析中的应用进展[J].李媛，毛翔，胡军，杨海，王怀记．公共卫生与预防医学.2021(03)

[3]唐氏综合征产前筛查研究进展J.马坤，马胜举，倪敏，张垒，欧阳运佳，赵德华．航空航天医学杂志.2020(12)

[4]基于荧光免疫分析技术的食品中污染物检测方法研究进展J.杜戎，虞睿宁，袁好，张倩瑶，郭亚辉，姚卫蓉，钱和.食品工业科技.2021(16)