白藜芦醇结合电针对脑缺血再灌注大鼠Bax、caspase-3蛋白表达的影响

白藜芦醇结合电针对脑缺血再灌注大鼠Bax、caspase-3蛋白表达的影响

 ,张晋霞1,苏会超2邵雅丽3张海明1

1. 华北理工大学附属医院，河北唐山，063099   2.玉田县中医医院，河北唐山，064199  3.唐山工人医院，河北唐山，063000

摘要目的：探讨白藜芦醇结合电针对脑缺血再灌注大鼠Bax、caspase-3蛋白表达的影响。方法：将80只雄性SD大鼠随机分为假手术组（20例）、I/R组（20例）、白藜芦醇组（20例）、联合治疗组（20例）。I/R组和联合治疗组给予改良线栓法制备大鼠大脑中动脉缺血再灌注损伤模型，在大鼠缺血2h后，给予联合治疗组白藜芦醇腹腔注射，术后第1天开始对患侧肢体穴位进行电针治疗。比较各组大鼠脑组织Bax、Caspase-3蛋白水平。结果：白藜芦醇组、联合治疗组Bax、Caspase-3蛋白较I/R组均显著降低（P＜0.05），联合治疗组较白藜芦醇组Bax、Caspase-3蛋白水平显著降低，组间差异显著（P＜0.05）。结论：白藜芦醇联合电针治疗可以显著下调Bax蛋白和Caspase-3蛋白表达，从而对脑缺血再灌注损伤起保护作用。

关键词：脑再灌注损伤；白藜芦醇；电针；Bax；caspase-3

缺血性脑血管病是常见于临床的脑血管疾病，治疗首选对相应部位血氧供应的恢复，但在恢复血流的同时，钙超载、炎症反应、凋亡、血脑屏障(BBB)损伤等机制造成脑组织损伤的进一步加重，即再灌注损伤[1]。

1 材料与方法

1.1 动物分组与造模

采用北京华阜康公司的SPF级健康雄性SD大鼠80只作为研究动物，体重250～300g。

将大鼠按照随机分组原则分为假手术组（20例）、I/R组（20例）、白藜芦醇组（20例）、联合治疗组（20例）。假手术组只分离血管，不结扎血管；其他组均建立MCAO模型。采用改良的Longa法进行造模，大鼠以10%水合氯醛350mg/kg麻醉后进行备皮、消毒，切开颈部正中皮肤，分离组织。找到右侧颈外A，结扎其远端。动脉夹夹闭右侧颈内A、颈总A。在右侧颈外A刺破一小口，将MCAO栓线从颈外A插入，松开颈内A动脉夹，将MCAO栓线插入颈内A，深度为18.5±0.5mm，待有阻力感后停止，2h后将栓线拔出约10mm。

1.2治疗方法

白藜芦醇组和联合治疗组给予白藜芦醇腹腔注射，剂量为40mg/kg/d，假手术组和I/R组腹腔注射等体积生理盐水。

联合治疗组同时给予电针治疗，于造模后第２天，大鼠清醒状态轻柔抓取固定，参照《实验

针灸学》中“动物针灸穴位图谱”定位大鼠右侧“曲池”“足三里”。针灸针直刺进针3～5mm，同侧两穴位连接１对电极，疏密波，频率2Hz/15Hz，电流强度为2～4mA（以肢体轻颤为度），20min/次，１次/d，连续7ｄ。其余组仅以相同方法抓取固定，不施以电针。

1.3观察指标及方法

在第7天治疗结束后，迅速将大鼠断头取脑，冻存备用。检测时取大鼠的海马组织提取总蛋白，加细胞裂解液至冰上30min后粉碎细胞，4℃10000r·min-1离心10min，收集上清，-80℃保存。BCA法测蛋白浓度，根据蛋白浓度取等量蛋白，加5×SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)上样缓冲液煮沸5min，进行SDS-PAGE电泳后将蛋白转移到PVDF膜上，用缓冲盐溶液(TBST)封闭液置摇床上封闭2h，经1×TBST充分漂洗(5min×3次)，分别加兔抗鼠Bax多克隆抗体、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗体(稀释度为1:1000)，4℃摇床过夜，充分漂洗后加山羊抗兔二抗(稀释度为1:1000)，室温摇床上孵育2h，充分漂洗，化学发光法显色。用β-actin做内参重复以上步骤。采用Gel-Proanalyzer软件分析图像，以Bax/β-actin，Caspase-3/β-actin比值分别表示目的蛋白的相对表达水平。

1.4统计学处理

使用IBM SPSS 24.0统计软件进行分析，数据以(x±s)来表示。多组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2结果

I/R组大鼠Bax、Caspase-3蛋白水平均较假手术组显著升高（P＜0.05）；白藜芦醇组、联合治疗组Bax、Caspase-3蛋白较I/R组均显著降低（P＜0.05），联合治疗组较白藜芦醇组Bax、Caspase-3蛋白水平显著降低，组间差异显著（P＜0.05），见表1。

表1  大鼠Bax、Caspase-3蛋白水平比较（x±s）

3讨论

缺血性脑卒中属中医“痿证”范畴[2]。针灸是中国传统医学的重要组成部分，是补充替代医学疗法的一种形式，电针是在针刺入腧穴得气后，通以接近人体生物电的微量电流以防治疾病的针灸方法。目前，在疼痛和脑卒中康复治疗中，电针已经得到了较广泛的应用，大量的临床研究证实电针对脑部缺血具有明确的治疗作用[3]。

本研究选择“曲池”“足三里”为电针主治穴，该二穴位于气血丰沛的阳明经上，理论上对该穴位的刺激可以使气血转运通达濡养大脑，进而改善痿证。

研究所用的白藜芦醇，在以往研究中证实可以减轻脑缺血再灌注损伤，本研究将其与电针联合用于治疗脑缺血再灌注大鼠，联合治疗组的Bax和Caspase-3蛋白水平显著降低，提示该治疗方案可能通过此途径抑制细胞凋亡，减轻再灌注损伤。

参考文献

[1]辛紫媛,靳晓飞,周晓红,等.补阳还五汤通过SIRT1/NF-κB p65信号通路减轻大鼠脑缺血/再灌注损伤[J].中国病理生理杂志,2022,38(08):1454-1462.

[2]王强,王玥.电针内关、百会通过NLRP3/ASC/Caspase-1通路干预局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠的作用研究[J].湖南中医药大学学报,2022,42(08):1335-1340.

[3]周玉嘉,张志辰,周晶,等.三七总皂苷早期干预对脑缺血再灌注损伤大鼠NLRP3/IL-1β信号通路相关因子表达的影响[J].中华中医药杂志,2021,36(12):7275-7278.