PCR实验技术的影响因素和对策

PCR实验技术的影响因素和对策

王晓英  ,杨艳

营山县疾病预防控制中心   四川南充   637700

摘要：PCR主要是指生物学的聚合酶链式反应，PCR实验技术虽然简单，但是该技术很容易受到各种因素影响，影响实验结果。基于此，本文对PCR实验技术的影响因素和对策展开研究，以供参考。

关键词：PCR实验技术；影响因素；对策

引言

PCR实验技术作为一种生物学技术，如今在生物领域获得了非常广泛的应用，尤其是在微生物病原学监测中的应用最为普遍[1]。PCR实验技术在对病原微生物的溯源、变异中发挥着重要作用，但是在实际检测过程中，却很容易受到多种因素影响，干扰检测工作的顺利进行。因此对PCR实验技术的影响因素与对策研究非常有必要。

一、什么是PCR？

PCR（聚合酶链式反应）作为一种可以对特定RNA或DNA片段进行放大的分子生物学技术，该技术可以看作为一种对生物体外特殊的DNA进行复制，而该技术的最大特点就是可以将极少量的DNA分子大幅度增加[2]。所以，就算是远古生物化石、历史人物残留的躯体，乃至十几年、几十年前犯罪分子所遗留的皮肤组织、血液、毛发等等，只要能从中分离出很少量的DNA，就可以借助PCR实验技术进行放大对比。该技术的原理就是利用DNA在体外95℃的环境时，会变性为单链，而在60℃的环境时引物会与单链按碱基互补配对的性质，通过将温度控制在72℃左右，为DNA聚合酶反应创造最佳温度。PCR实验技术的特点就在于引物与单链按碱基互补配对后，可以进行延伸，并形成两条新链，而新链又在此基础上配对、合成，不断扩增。

二、PCR实验技术反应构成与影响因素分析

在PCR实验技术反应体系主要有七个成分，对影响PCR实验技术的因素分析也应当从这七个成分入手。

1.DNA聚合酶

在PCR实验技术中，通常PCR反应需要大概0.5至2.5个单位的连接酶Taq DNA，依照常规的Taq DNA来举例，每个反应体重会有大概2×1012至10×1012个单位的酶分子，但由于Taq DNA的延伸反应速率大约在0.7左右，所以在扩增的产物在反应体系中达到1.4×1012至7×1012个单位的酶分子时，此时的酶分子已经接近枯竭，因此会限制PCR实验技术的反应。

2.引物

正常情况下，PCR反应所产生的每条引物的浓度为0.1μmol/L至0.5μmol/L，在这个浓度下，可以完成将近三十个DNA片段循环。但因为浓度也会随之增高，在高浓度状态下，引物与单链按碱基的配对错误概率会提升，甚至会导非特异扩增，对最终的反应结果带来影响。

3.脱氧核苷三磷酸

一个单位的PCR体系中会有四种等摩尔浓度的脱氧核苷三磷酸（dNTPs），但将DNA片段长度扩增至1000bp时，这四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）中的每一种等摩尔浓度就会达到20mol／L至200 mol／L之间，如果等摩尔浓度过高，就会和Mg2+螯合发生抑制反应，进而影响扩增结果。

4.二价阳离子

二价阳离子可以稳定DNA聚合酶，且DNA聚合酶需要二价阳离子的激活，一般会使用到Mg2+。因为Mg2+会与脱氧核苷三磷酸（dNTPs）和寡核苷酸结合，其反应体系的中的二价阳离子浓度需要高于脱氧核苷三磷酸（dNTPs）和引物的浓度，可以适当增加Mg2+的浓度，以达到减少非特异性扩增的目的，一般Mg2+的浓度要控制在4.5mmol/L左右，但这并不是绝对值，在PCR实验过程中还需要结合具体的实验条件和要求等来确定。

除了上述反应构成成分之外，PCR实验技术中还会涉及到缓冲液、一价阳离子和模板DNA。通常情况下，缓冲液中就涵盖一价阳离子所以不需要在额外添加。而模板DNA在使用过程中不需要使用过多，否则会影响新合成的DNA产量。

三、核酸提取操作与注意事项

1.核算提取操作

核酸提取是临床PCR实验技术中最为关键的一部分，核酸提取的成效会直接影响到PCR实验最终检测结果。然而，核酸提取也是最溶于出现问题的一个环节。在细胞中，核酸总是和大分子物质结合在一起，而核酸提取操作就是将核酸 从大分子物质中分离开，如：脂肪、蛋白质以及多糖等等。在开展提取操作时，应当确保核酸分子的一级结构不受破坏，并防止污染其他分子。而提取操作可以借助化学作用、机械作用或是酶作用等形式。由于核酸为高电荷磷酸骨结构，所以其和大分子物质相对比，亲水性更强，可以借助组织中各个成分理化性质的差异性来完成多余成分的分离，可以借助选择性沉淀的方式来完成核酸提取。借助氯仿可以完成脂肪去除促使蛋白质变性，以提升核酸提取效率。又或是可以吸取上层水，然后再借助异丙醇来浓缩核酸，浓缩后的核酸会形成沉淀，以离心的方式将沉淀后的核酸进行收集，用浓度为75%的乙醇进行漂洗，可以得到纯化后的核酸。

2.核酸提取操作注意事项

在核酸提取操作中需要注意污染问题，这种污染不仅是样品对操作人员之间的相互污染，还有核酸提取样品之间的交叉污染，主要是因为污染会影响最终结果，并造成假阳性的情况。在核算提取操作时，操作人员还需要做到细致操作，避免在操作过程中造成核酸断裂或流失，最终影响核酸产量和结果。此外，在提取RNA时，应当控制RNA酶的活性，由于操作人员所使用的器皿、毛发或是被污染的试剂中都有可能存在RNA酶，所以在操作时需要小心，防止RNA酶降解核酸。

四、PCR实验技术要点分析

为避免PCR实验技术受到影响，在具体操作过程中应当注意以下几点：第一，为避免PCR实验技术反应体系受污染，可以在安装紫外灯的工作台添加PCR试剂，在不使用工作台时打开紫外灯，将PCR专用微量离心机防止在工作台中，并准备好工作台其他必须物品。在使用离心管或是缓冲液等物品前，需要进行高压处理；第二，PCR配液区操作要规范性，标准化。如：要做到勤更换手套，避免对DNA模板造成污染；做好各个试剂的标注工作，做到专剂专用；配液工作需要在专区进行，以防止出现污染；第三，对PCR实验技术反应程序进行优化，尽可能提升扩增效率，提高产物。

参考文献：

[1]吕爱民,柳啸.高中生物学PCR技术中“引物”相关问题归类分析[J].生物学通报,2022,57(01):40-43.

[2]徐蕾,肖桂清,盛晓菁,戚智青,刁勇.PCR增强剂在核酸体外扩增检测技术的研究进展[J].生物技术进展,2020,10(02):137-143.