采用高效液相色谱法分析苯甲酸中邻苯二甲酸的含量

采用高效液相色谱法分析苯甲酸中邻苯二甲酸的含量

刘冬梅

湖北科林博伦新材料有限公司  443200

摘要：本方法是一种采用高效液相色谱法测定苯甲酸中邻苯二甲酸含量的方法，采用反相色谱中常用的甲醇-缓冲盐混合溶液体系，外标法定量分析邻苯二甲酸含量的分析方法。其色谱条件为：色谱柱：Poroshell 120 EC-C18 4.6mm x 150mm，4-Micron；流动相：甲醇：0.03mol/L缓冲盐的体积比为20：80配制而成；流速：1mL/min；检测波长：230nm；柱温：30℃；进样量：20μL。该方法具有样品处理及分析过程简单，分析结果准确性高，重现性好等优点。

关键词：苯甲酸  邻苯二甲酸  高效液相色谱

前言

邻苯二甲酸（C8H6O4）是苯二甲酸异构体中的一个，苯环上的两个羧基位于邻位。它有两个异构体：间苯二甲酸和对苯二甲酸。邻苯二甲酸主要用于制取邻苯二甲酸酐，后者是生产染料、香水、糖精、邻苯二甲酸酯、酚酞等化学品的前体。目前苯甲酸国标GB1886.183-2016中分析方法存在以下几个弊端：

（1）使用甲醇-乙酸溶液为流动相，基线存在较大波动，导致无法精确定量分析

（2）乙酸的酸性若于邻苯二甲酸酸性，从而无法保证邻苯二甲酸分子形式存在，最后影响定量分析的准确性。

（3）乙酸在紫外区内本身有一定吸光度，而且乙酸属挥发性酸，随着时间推移流动相PH及本底（基线）均会发生变化，无法适用多样品、长时间的定量分析。

1 仪器和试剂

1.1仪器 安捷伦液相色谱1260

1.2试剂 邻苯二甲酸标准品，色谱纯甲醇，磷酸二氢钾，磷酸

2 最佳测定条件考察

2.1波长的选择

使用紫外可见分光光度计在190nm-810nm对邻苯二甲酸甲醇溶液及苯甲酸甲醇溶液进行连续扫描，邻苯二甲酸在226nm处有最大吸收（图1、2），苯甲酸在224nm处有最大吸收（图3、4）。国标上提供的邻苯二甲酸最大吸收波长为228nm。

图1 邻苯二甲酸峰值检测

图2 邻苯二甲酸选点检测

图3 苯甲酸峰值检测

图4 苯甲酸选点检测

图5 各波长邻苯二甲酸吸收图谱

经检测比对邻苯二甲酸最大吸收波长及对应的吸收图谱，该物质在224nm、226nm、228nm、230nm四个波长没有明显的吸收差异，而在230nm波长下样品中其余杂质吸收较低。故本方法选用230nm波长进行实验。

2.2流动相选择

邻苯二甲酸与苯甲酸虽然都是微溶于水，但为保证分析结果准确性，应防止他们溶于水后、在碱性或中性条件下离子化，所以应选择酸性的水相，常用甲酸pka=3.75、乙酸（冰醋酸）pka=4.75、磷酸pka=2.12作为酸性溶质配制无机相，使用邻苯二甲酸标准溶液验证三种酸性水相的实验效果：

（1）国标（GB 1886.183-2016）使用甲醇:乙酸溶液=30:70，存在拖尾峰且基线无法平稳（产生较多杂峰），无法适用。

（2）将流动相变更为甲醇：甲酸溶液=30:70后，基线依旧无法平稳，无法适用。

（3）将流动相变更为甲醇：磷酸溶液=30:70后，基线平稳、无杂峰影响分析，但依然存在峰拖尾现象。

（4）针对峰拖尾，我们采用缓冲盐进行调节，而根据邻苯二甲酸pka1=2.95，pka2=5.41，应选择缓冲范围在pka1±1pH（即PH 1.95-3.95）内的酸性缓冲盐，符合要求的有乙酸铵（缓冲范围3.76～5.76），甲酸铵（缓冲范围2.75～4.75）及磷酸二氢钾pka1=2.15、pka2=7.21。

由上述电解常数与缓冲范围可知乙酸铵（醋酸铵）与甲酸钠均不适用，原因如下：

①邻苯二甲酸电解常数均小于甲酸和乙酸（冰醋酸），故使用乙酸铵和甲酸铵均会导致样品中邻苯二酸与流动相中反应，生成邻苯二甲酸铵盐，从而影响分析准确性。

②醋酸铵无法提供较低且稳定的酸性环境，若强行调低PH会导致缓冲盐缓冲效果失效，使用缓冲盐就没意义了，不如直接使用乙酸，而乙酸在流动相中并不能提供稳定平稳的分析基线，产生杂峰影响分析。

下图为甲醇：（0.03mol/L乙酸铵，磷酸调pH=4）=80:20进行实验：

由上图可知，基线不平稳且会存在至少4min和6.8min两个峰。不同浓度中的两个峰含量均在变化，无法准确定性，故不适用。同理甲酸铵，也无法适用。

综上所述：

最终选用即不与邻苯二甲酸反应、能保持流动相低于酸性条件、能明显改善峰型、准确定性出峰时间、不影响标样进行定量分析的磷酸二氢钾作为缓冲盐。缓冲盐的配比为0.03mol/L磷酸二氢钾，用磷酸调pH至2.8。

2.3流动相配比优化缓冲盐

2.3.1 缓冲盐：甲醇=70:30

在此条件下，邻苯二甲酸峰前面有杂质峰未分离，且样品中前后均未分离。

出峰时间为3.72min[对称因子0.854]。

2.3.2 缓冲盐：甲醇=75:25

在此条件下，邻苯二甲酸与前杂质峰分离，但基线波动较大，且分离时间不够，若之间有杂质就无法分离。出峰时间为4.88min[对称因子0.866]。

2.3.3 缓冲盐：甲醇=60:40

在此条件下，邻苯二甲酸峰前面峰拖尾，导致邻苯二甲酸峰型对称性差。

出峰时间为2.5min[对称因子0.837]。

2.3.4缓冲盐:甲醇=80:20

在此条件下，邻苯二甲酸峰与前面的峰完全分离，且有足够的分离时间。

出峰时间为6.68min[对称因子0.906]。

在条件（2.3.4）下分析样品，得到色谱图谱如下：

综上所述：

流动相比例在0.03mol/L磷酸二氢钾（磷酸调pH2.8）：甲醇=80:20时，分离好、对称性好可以有效保证分析定量的准确性。

2.4分析时间优化

根据1.2.5.4以流动相比例在0.03mol/L磷酸二氢钾（磷酸调ph2.8）：甲醇=80:20得到的样品图谱可知苯甲酸出峰时间在25min左右，样品完全走完需要约35-40min。目标峰在6min左右，故待目标峰完全出峰后可增大有机相比例至40%使试样快速流出，可节约15-20min左右的分析时间。（有机相比例不宜过多防止磷酸盐析出堵塞系统）

样品分析时间优化谱图：

根据流动相选择及比例优化中实验趋势可知，当增加甲醇比例，出峰时间会提前，为节约分析时间，但又不影响邻苯二甲酸（6min出峰），我们在10min后采用缓冲盐：甲醇=60:40的比例运行5min使后出峰的苯甲酸尽快与色谱柱分离，在变为原比例走至基线平稳。

2.5 最终仪器分析条件：

色谱柱：C18  150mm*4.6mm，4-Micron；

温度：30℃ ；波长：230nm

流动相：

3 标准溶液的配制

准确称取纯度99%的邻苯二甲酸标准品0.1024g，用色谱甲醇定量至10.0113g，此时浓度为1.0126%（g/g），记为A溶液。

称取2.5064g的A溶液，用流动相定量至100g，此时浓度为0.0254%(g/g)，记为B溶液。

标样1：称取B溶液0.0493g，加入20mL色谱甲醇，用缓冲盐定容至50mL，此时浓度为0.2504μg/mL。

标样2：称取B溶液0.0995g，加入20mL色谱甲醇，用缓冲盐定容至50mL，此时浓度为0.5055μg/mL。

标样3：称取B溶液0.1559g，加入20mL色谱甲醇，用缓冲盐定容至50mL，此时浓度为0.7920μg/mL。

标样4：称取B溶液0.2034g，加入20mL色谱甲醇，用缓冲盐定容至50mL，此时浓度为1.0333μg/mL。

标样5：称取B溶液0.2930g，加入20mL色谱甲醇，用缓冲盐定容至50mL，此时浓度为1.4884μg/mL。

4 建立校正曲线

按缓冲盐：甲醇=80:20比例走基线至波动小于0.5mAu后，以测定样品的条件测定标样，仪器自动绘制校正曲线，曲线相关系数大于0.999，曲线如下图所示

5 样品配制

由于苯甲酸、邻苯二甲酸在水中溶解度低，为保证样品完全溶解定容以及样品溶液与流动相接触后不析出，我们进行溶解验证：

5.1 溶解实验

为尽可能避免进样后溶剂比例波动带来的溶剂峰，溶剂最好为80:20的流动相。经试验，苯甲酸样品无法溶解于已按比例（0.03mol/L磷酸二氢钾（磷酸调pH2.8）：甲醇=80:20）混合好的流动相中。苯甲酸、邻苯二甲酸均属微溶于水，且在流动相中无法溶解，故先用甲醇溶解，再加入盐溶液进行试验。

①称取1g左右苯甲酸样品，加入10ml甲醇，完全溶解，但加入少量盐溶液后析出，若继续加入盐溶液会导致更多的样品析出。

②称取0.5g左右苯甲酸样品。加入10ml，完全溶解，加盐溶液至50ml，有析出。

③称取0.5g左右苯甲酸样品。加入20ml，完全溶解，加盐溶液至50ml，无析出。

结论：从以上溶解实验可以得出，第③中溶解比例最佳。

5.2 样品溶液与流动相混合实验

样品溶液：称取0.5g左右苯甲酸样品于50mL容量瓶，加20mL色谱甲醇溶解，再用pH=2.8 0.03mol/L的磷酸二氢钾定容至50mL，摇匀。

流动相溶液：0.03mol/L磷酸二氢钾（磷酸调pH2.8）：甲醇按80:20比例混合。

将上述两种溶液按下表格中比例进行混合：

最终样品配制方法：

称取0.5g左右苯甲酸样品，加入20ml甲醇，完全溶解后，用盐溶液定容至50ml。

6加标回收实验

加标回收的结论：回收率为97.3%—103.7%，满足分析需求。

7精密度

按该方法对同一份样品在优化条件下连续测定5次，最大差值的绝对值

不大于测量值的算术平均值的1%，远低于国标GB 1886.183-2016要求的20%。

8 参考文献

[1]李显文等.高效液相色谱法测定苯甲酸钠中邻苯二甲酸含量[J],生物化工,2018,4(3):105-107.

[2]卢姝等.用高效液相色谱法分析精对苯二甲酸残渣[J],化工环保，2008，28(1).

[3]周红,陈天舒,薛艺.采用气相色谱法测定邻苯二甲酸[J];高师理科学刊[J],1999,2.

[4]张晓峰.反相高效液相色谱法测定废水中的邻苯二甲酸酯类化合物[J].石化技术.2001.04.