蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法验证

蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法验证

杨晓燕, ,熊燕飞 ,黄筱婷 ,杜翠梅

云南白药集团股份有限公司，云南 昆明 650500

摘要：目的：建立一个用液相色谱法测定中蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法。方法：色谱柱：岛津 WondaSil C18 Superb(5μm，150×4.6mm)；流动相: 以甲醇–水（10：90)为流动相 ；检测波长为285mn，柱温30℃，流速1.0ml/min。结果：通过对蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法进行系统适用性试验、精密度试验、检测限、定量限、线性关系与线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验）的验证，确保检验方法对被检物质有足够的专属性和灵敏度，通过重复性试验和回收率试验验证检验过程的回收率和重现性，并确定羟甲基糠醛的线性范围、定量限，以确定HPLC-UV法在本实验室的适用性及可控性。

关键词：羟甲基糠醛；UV检测器；方法确认

1．仪器与材料

1.1 样品：蜂蜜一批

1.2 方法选择：按照GB/T 18932.18-2003蜂蜜中羟甲基糠醛含量测定项下用高效液相色谱法测定蜂蜜中的羟甲基糠醛的含量方法。

1.3 仪器及试药:

1.3.1高效液相色谱仪：

美国安捷伦1100高效液相色谱仪系统（配有紫外检测器、四元梯度泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱）。

1.3.2色谱柱：岛津 WondaSil C18 Superb(5μm，150×4.6mm)

1.3.3试剂

甲醇，色谱级，德国默克

超纯水，自制，使用前经0.45μm滤膜滤过后使用

羟甲基糠醛标准品， 来源中国食品药品检定所. 

1.3.4天平：电子天平（0.1mg /0.01mg）

1.4 试验方法

  依据GB/T 18932.18-2003蜂蜜中羟甲基糠醛含量测定方法的具体内容如下：

1．4.1 系统适用性试验:照高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适应性  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂 ；以甲醇–水（10：90)为流动相 ；检测波长为285mn，柱温30℃，流速1.0ml/min。

对照品溶液的制备  准确称取适量的羟甲基糠醛标准物质于100ml容量瓶，用10ml甲醇溶解，用水稀释至刻度，配成0.20mg/ml的标准储备液。分别吸取适量的羟甲基糠醛标准储备液至100ml容量瓶中，用10%甲醇溶液稀释至刻度，配成0.10μg/ml，0.20μg/ml，1.0μg/ml，2.0μg/ml，4.0μg/ml，6.0μg/ml，10.0μg/ml的标准工作溶液。

供试品溶液的制备  称取10g试样，精确至0.01g，置于100ml烧杯中，加入10ml甲醇，用玻璃棒轻轻搅拌均匀，使试样完全溶解，转移至100ml容量瓶中，用水稀释至刻度，充分混匀，用0.45μm的滤膜过滤，取续滤液，即得。

测定法  分别精密吸取七个标准工作溶液各10μL，注入色谱仪，测定，记录峰面积，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线，然后吸取供试品溶液10μl注入色谱仪，记录峰面积。

        各项测试结果表明：在本实验室内该方法系统适用性能够满足要求。

1.4.2精密度试验：

精密吸取羟甲基糠醛标准储备液10μl，按测定方法重复进样6次，测定峰面积值。对各次测得的峰面积值求相对标准偏差，相对标准偏差应不得过2.0%，用以说明仪器精密度情况。

相对标准偏差小于2.0%，说明仪器精密度良好。

 1.4.3  线性关系与线性范围考察

精密量取按上述对照品溶液制备方法制备的浓度为0.20mg/ml的羟甲基糠醛标准储备液，将储备液稀释成对照品溶液系列；分别取上述7个浓度的对照品溶液10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积；以峰面积为纵坐标，以对照品浓度（μg/ml）为横坐标作线性回归，绘制标准曲线。

最后得羟甲基糠醛回归方程：y=58.935x-0.18（R2=0.9999）。试验表明，羟甲基糠醛在0.10ug/ml~10.0ug/ml~之间呈良好线性关系。

1.4.4 检测限的确定

取一定浓度的对照品溶液，精密量取10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，满足信噪比3:1为最低检测限的要求。按上述色谱条件进行测定，以3倍的噪声作为方法的最低检测限，测得羟甲基糠醛的定量限为0.025μg，信噪比为3.4：1。

1.4.5 定量限的确定

取一定浓度的对照品溶液，精密量取10μl注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，满足信噪比10:1为定量限的要求。按上述色谱条件进行测定，以10倍的噪声作为方法的最低检测限，测得黄芩苷的定量限为0.05μg，信噪比为9.1:1。

1.4.6重复性试验：

取1批蜂蜜，取供试品6份，依法测定。同时，取标准工作溶液照测定法测定，分别计算出羟甲基糠醛含量，测定结果见表4。

表4  重复性试验结果

相对标准偏差小于2.0%，说明本方法在本实验室内重复性好。

1.4.7加样回收率试验（准确度试验）

采取全程加样法。取6份已知含量的蜂蜜，精密称定，按照100%浓度精密添加羟甲基糠醛标准品适量，按含量测定方法测定，同时取羟甲基糠醛标准工作溶液，依法测定，并计算出羟甲基糠醛的含量。

试验结果，平均回收率为100.52%（RSD=0.42%）。结果较满意，表明本法适用于本实验室。

2、结论

通过对蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法进行系统适用性试验、精密度试验、检测限、定量限、线性关系与线性范围考察、重复性试验、准确度试验（加样回收试验），各项试验测试结果均能满足要求，仪器性能稳定，质控结果满意。

从以上数据可以看出用该方法检测蜂蜜中羟甲基糠醛的含量，结果准确可靠，可以在本实验室运用此方法检测蜂蜜中羟甲基糠醛的含量。

参考文献

GB/T 18932.18-2003 蜂蜜中羟甲基糠醛含量的测定方法 液相色谱-紫外检测法

1