头孢克肟颗粒含量测定方法的优化

头孢克肟颗粒含量测定方法的优化

李宏贞

海南海药股份有限公司，海南省海口市，邮编：570100

【摘要】目的：中国药典ChP中头孢克肟含量测定方法耐用性较差，（E )异构体峰与头孢克肟峰分离度不理想，优化测定头孢克肟含量的高效液相方法。方法：采用高效液相色谱法，色谱条件：采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（150 mm×4.6，5 µm），流动相为pH3.2乙酸铵缓冲盐-甲醇（80:20）；流速为1.0ml/min；柱温35℃；检测波长254 nm。结果：优化后的测定方法（E )异构体峰与头孢克肟峰分离度达到9.30＞2.0，符合要求。 结论：高效液相色谱法简便、可靠，专属性强，可用于头孢克肟的含量测定。

【关键词】头孢克肟；含量测定；高效液相色谱法

前言

头孢克肟具有强大的杀菌抑菌作用[1]，抗菌谱广，组织穿透力很强，耐 β－内酰胺酶，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有效，能有效抑制耐受氨苄西林、头孢克洛、头孢氨苄的流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、淋球菌等致病菌，临床上主要来用于治疗尿道、呼吸道感染，胆道炎胆囊炎等[2]药物不良反应较少，尤其适用于儿童，用于治疗小儿感染性腹泻[3]、急性上呼吸道感染[4]、支气管肺炎[5]细菌性肠炎等[6]。《中国药典》2020年版及文献资料[7-9]中头孢克肟及其制剂含量测定项下均为采用四丁基氢氧化铵溶液作为流动相的反相离子对液相色谱法，其方法的不足之处是色谱柱对四丁基氢氧化铵有较强的吸附性，使用该流动相后柱效和峰形不理想，分离度不符合要求。且色谱柱使用数十次后，柱压上升，柱效下降，造成色谱柱使用寿命缩短，从而提高了检验成本[10]。参考USP-PF对头孢克肟含量测定的色谱条件进行优化，并研究确认强降解试验下系统适用性的符合性，以便更加有效、可靠地测定头孢克肟制剂中头孢克肟的含量。

1.仪器与试药

1.1仪器

Waters2695高效液相色谱仪（美国 Waters 公司）；AE240电子分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2试药与试剂

头孢克肟对照品（纯度：89.2%，批号：130503-201205）由中国食品药品检定研究院提供；甲醇为HPLC级；乙酸铵、磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钠、四丁基氢氧化铵均为分析纯。

2.方法

2.1ChP202测定方法

2.1.1色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为Waters symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相为四丁基氢氧化铵溶液（取10%四丁基氢氧化铵溶液25ml，加水1000ml，摇匀，用磷酸溶液调节pH值至7.0)-乙腈（72:28)；检测波长254nm，流速1.0ml/min，柱温40℃，进样量20μl。

系统适用性溶液：精密称取头孢克肟约10mg置于10ml容量瓶中，加水10ml溶解制成每lml中约含1mg的溶液，于沸水浴上加热45分钟，冷却，作为系统适用性溶液。取系统适用性溶液适量，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，记录色谱图。结果见表1，头孢克肟峰和(E)异构体峰之间分离度为1.521，符合要求。

表1  ChP2020含量测定方法测定结果

2.1.1耐用性试验 

2.1.1.1色谱柱耐用性考察  色谱柱1：Waters symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm）；色谱柱2：COSMOSIL SC18-PAQ（4.6mm×150mm）；色谱柱3：Thermo scientific Hypersil GOLDTM（4.6mm×150mm）；分别取系统适用性溶液适量，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，记录色谱图，结果色谱柱1和色谱柱3头孢克肟峰和(E)异构体峰之间分离度均大于1.5，符合要求。而色谱柱2头孢克肟峰和(E)异构体峰之间分离度小于1.5，不符合要求，根据图谱的峰型，本测定方法初步选择Waters symmetry C18（4.6mm×150mm，5μm）。

2.1.1.2流动相pH值耐用性考察  分别考察流动相四丁基氢氧化铵溶液pH值6.8和pH值7.1，；分别取系统适用性溶液适量，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，记录色谱图。结果见表2。结果两个不同pH值（E）异构体峰与头孢克肟峰间的分离度分别为均小于1.5，均不符合要求。

表2  ChP2020优化流动相pH值的选择

2.2USP测定方法

2.2.1色谱条件与系统适用性试验  采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为4.6mm×150mm，粒径为5μm为色谱柱（4.6mm×150mm，5μm）；以四丁基氢氧化铵溶液（量取25ml 0.4M的四丁基氢氧化铵至1000ml水，1.5mol/L磷酸溶液调节pH至6.5）-乙腈（75:25）为流动相，用溶液A（13.6g/L的磷酸二氢钾）将溶液B（14.2g/L无水磷酸氢二钠）调节至pH7.0为稀释剂，检测波长254nm，流速1.0ml/min，柱温40℃，进样量10μl。

系统适用性溶液：取“2.1.1”项下的系统适用性溶液适量，注入液相色谱仪，在上述色谱条件下测定，记录色谱图。结果系统适用性溶液色谱图中（E )异构体峰与头孢克肟峰分离度均大于1.5，但是头孢克肟峰发生峰分裂。通过以上Chp2020和USP43对比，发现ChP2020药典流动相为pH7.0四丁基氢氧化铵溶液-乙腈（72：28），与USP43中流动相为pH6.5四丁基氢氧化铵溶液-乙腈（75：25）相差不大，首先流动相中盐的浓度一致，其次是流动相中盐与乙腈的比例，通过前文叙述的方法优化过程和结果，从结果看出，照搬药典上的检测方法并通过改变流动相比例和pH值得到耐用、稳定的含量检测方法是行不通。因此，我们参考了USP-PF2020有关物质流动相体系，更换为乙酸铵和甲醇，但此方法中有关物质的检测为梯度条件，通过主峰出峰时间和梯度比例，我们将流动相比例初步定为乙酸铵：甲醇（80:20），并继续进行试验。

表 3 方法确认结果-USP43方法

2.3 USP-PF方法优化

2.3.1色谱条件与系统适用性试验  用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙酸铵缓冲盐（0.05M乙酸铵溶液，用磷酸调节pH至3.0）-甲醇（80:20）为流动相；检测波长为254nm；柱温为40℃；进样体积20μl。取系统适用性溶液适量，注入液相色谱仪，分别考察不同柱温、不同流动相比例、不同流动相pH值等，上述色谱条件下测定，记录色谱图。根据耐用性考察结果，最终选择柱温35℃；流动相比例为缓冲盐-甲醇（80:20）；pH值为3.2最佳。

2.3.2 专属性试验

对日落黄空白辅料进行检测，头孢克肟出峰时间约为7min，日落黄出峰时间为16min，分离度良好，从结果可知辅料日落黄不干扰头孢克肟出峰，专属性符合要求。

2.3.3强降解试验

   为了进一步确定优化后的方法是否合适，取自制品进行强制降解试验，在酸、碱、氧化、强光、高温等条件下，改方法是否还适用。

色谱条件  色谱柱为C18，4.6mm×150mm，5μm，以乙酸铵缓冲盐（0.05M乙酸铵溶液，用磷酸调节pH至3.2）-甲醇（80:20）为流动相，检测波长254nm，柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量20μl。

系统适用性溶液  精密称取头孢克肟约10 mg，置于10ml容量瓶中，加水超声10min使完全溶解，用水稀释至刻度，并稀释制成每lml中约含1mg的溶液，于沸水浴95℃上加热10分钟，冷却，即得。

对照品溶液  精密称取头孢克肟对照品约10mg，置于50ml量瓶中，加稀释剂[用溶液B（称取磷酸二氢钾6.8g，加水500ml溶解）将溶液C（称取无水磷酸氢二钠7.1g，加水500ml溶解）调节pH至7.0]超声10min溶解后，用稀释剂稀释至刻度，摇匀。

供试品溶液  取本品约1000mg（相当于头孢克肟50mg）置于50ml容量瓶中，加2/3容量瓶体积的稀释剂，超声溶解，用稀释剂稀释至刻度，制成每1ml中含头孢克肟1mg的溶液。

空白破坏溶液：0.1M氢氧化钠溶液：0.4g氢氧化钠→100ml；0.1M盐酸溶液：0.9ml盐酸→100ml；0.3%过氧化氢：取1ml 30%过氧化氢→100ml。

分别取0.1M盐酸溶液、0.1M氢氧化钠溶液、0.3%过氧化氢按照一定的浓度配制成供试品溶液。而高温条件则是取本品制成每1ml中含头孢克肟1mg的溶液，在95℃水浴锅中加热15分钟，取出放冷，制成高温破坏供试品溶液；而光照条件则是在4500lux±500lux的条件下连续放置20个小时。

分别取空白溶剂、酸碱空白溶液、氧化空白溶液、系统适用性溶液、对照品溶液、未破坏与破坏条件下的供试品溶液各进样1针，记录色谱图。

表4  强制降解试验结果

主峰专属性良好，主峰与相邻峰之间分离度大于1.5，降解峰不影响头孢克肟峰的出峰和检测。头孢克肟在碱和高温中不稳定，在酸、氧化和光照条件下较稳定。

3优化后的色谱条件

经过对头孢克肟颗粒含量测定方法的优化，最终确定的色谱条件如下：

色谱柱为C18，4.6mm×150mm，5μm，以乙酸铵缓冲盐（0.05M乙酸铵溶液，用磷酸调节pH至3.2）-甲醇（80:20）为流动相，检测波长254nm，柱温35℃，流速1.0ml/min，进样量20μl。

对三批样品检测，按照“3”项下方法分别进行测定。结果见表5。

表5  含量测定结果

4结论

本研究优化了头孢克肟含量测定的方法，并对该方法的系统适用性、专属性、进行了验证。结果表明，本法操作简便、准确、可靠，可用于头孢克肟含量的测定，为其质量控制及相关制剂制备提供试验依据。

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