HPV尿液检测在宫颈癌筛查中的研究现状

HPV尿液检测在宫颈癌筛查中的研究现状

王庆帝  ,曲媛媛

山东协和学院   山东济南  250200

摘要：高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染导致女性宫颈癌的发生。传统的高危HPV 检测需要收集女性宫颈脱落细胞或取宫颈活检组织，这些检测一般为侵入性。采用尿液检测女性这种是非侵入性的且可靠，这种方法，不仅可以使参与筛查的人群增加（包括儿童），还可以对接种宫颈癌疫苗的青少年进行高危型 HPV 检测。

目的：探讨应用尿液检测可以代替收集女性宫颈脱落细胞或活检组织的价值。

结论：HPV16E6 为宫颈癌相关的主要风险因子，尿液标本和宫颈脱落细胞标本检测用于检测宫颈癌及癌前病变患者 HPV16E6 基因有一定的一致性，可以代替宫颈脱落细胞检测高危 HPV。对于某些特殊人群（例如不方便来医院的女性、处女等），应用尿液检测高危 HPV 拥有一定的发展前景。

关键词：人乳头状瘤病毒；尿液检测；子宫颈癌；HPV16

一、背景

宫颈癌是发展中国家第二大最常见癌症，也是女性癌症死亡的第三大原因，每年估计有527600例新病例和265700例死亡.宫颈癌(Cervical cancer)是发病率仅次于乳腺癌的女性第二高发癌症，据世界卫生组织统计，目前全球宫颈癌发病人数逐年增加，2006 年报道为56万，其中80%在发展中国家，占发展中国家女性肿瘤的15%。我国为13万多，约占总数的26%，而每年死于宫颈癌的约5万。子宫颈癌的分布在种族差异，曾对我国8个少数民族进行调查，发现维吾尔族的宫颈癌死亡率最高，其年龄调整死亡率为17.27/10万，年龄组死亡专率起点高，上升幅度大。这已经很大程度影响了女性的平均寿命。

在本研究中，我们使用RQ-PCR检测评估了尿液样本检测HPV的可接受性。通过平行留取HPV阳性或疑似宫颈癌及癌前病变患者的尿液及宫颈脱落细胞，对检测结果为HPV16E6阳性标本进行测序分析，以验证其检测结果准确性；结合宫颈病理学诊断的结果，评价尿液标本和目前常用的宫颈脱落细胞标本用于检测HPV16E6的一致性，以及尿液用于检测宫颈癌及癌前病变的灵敏度及特异度，探讨应用尿液检测宫颈病变患者的HPV16E6基因的临床应用价值，为宫颈癌的筛查提供新思路，新方法。

三.、尿液的来源及实验

1.尿液中HPV感染细胞的来源

目前，关于尿液中HPV感染细胞来源有以下三种推断：①局限性尿道感染产生的脱落细胞；②下生殖道HPV感染产生的脱落细胞污染尿液。第一种来源的HPV感染细胞的检测结果难以真实反映出宫颈部位的HPV感染状态；后两种推断可以在一定程度上体现宫颈部位有无HPV感染及其严重程度。Sehgal等的研究提到尿道的解剖位置距离外阴、阴道及宫颈非常近，据此推测尿道上皮可能像宫颈-阴道上皮类似对HPV病毒易感，其研究发现支持第二种细胞来源。值得注意的是，现有研究大多提示尿液中HPV感染细胞很可能来自于宫颈/阴道部位的脱落上皮细胞。有报道指出晨尿或首段尿中HPVDNA含量高于中段尿或整段尿，推测可能的原因是女性尿道和下生殖道相距很近，来源于宫颈、阴道、外阴、尿道的脱落上皮细胞比较容易污染尿液，尤其是首段尿。尿液中HPVDNA的含量也受到排尿时间间隔的影响。此外，有研究数据显示宫颈细胞学标本和尿液标本的病毒载量以及型别有良好的一致性。HPV的阳性率在宫颈细胞学标本、阴道细胞学标本、尿液标本之间也呈降低趋势。由以上研究可以看出，尿液中的HPV感染细胞很可能来源于宫颈或阴道部位的脱落细胞。

2.实验方法与步骤

（1）样本DNA的提取宫颈脱落细胞标本DNA的提取

将采集有宫颈脱落细胞标本的保存液震荡混匀，取样本 500μ1，加 500μ1PBS 混匀洗涤两次，5000g离心5分钟，弃上清，细胞裂解液和蛋白酶 K（浓度 20g/L）55℃水浴消化过夜，采取酚-氯仿、异丙醇、乙醇沉淀分离基因组 DNA，干燥，Tris-盐酸缓冲液（TE）溶解。用紫外分光光度计测定DNA含量，以TE稀释DNA模板至统一浓度（100ng/μl），4℃保存或于-20℃备用。

（2）尿液 DNA 的提取

预处理后的尿液标本的全部取出混匀，5000g离心5分钟，弃上清，加500μ1PBS混匀洗涤两次，5000g离心5分钟，弃上清，细胞裂解液和蛋白酶K（浓度 20g/L）—7—55℃水浴消化过夜，采取酚-氯仿、异丙醇、乙醇沉淀分离基因组DNA，干燥，Tris盐酸缓冲液（TE）溶解。用紫外分光光度计测定DNA含量，以TE稀释 DNA 模板至统一浓度（100ng/μl），4℃保存或于-20℃备用。

（3）引物的设计与合成

根据已注册的HPV16E6基因序列(AF327851) Primer-3，应用美国生物医学基因研究中心的引物设计软件Primer-3设计出 HPV16E6基因引物，上游引物：5’-CACAGGAGCGACCCAGAAA-3′；下游引物：5’-GACATACATCGACCGGTCCAC-3′，扩增片段长约400bp。用Primer-3设计出β-肌动蛋白（β-actin）基因引物作为内参基因，上游引物：5'-AGCCATGTACGTTGCTATCC-3'，下游引物：5'-TTGGCGTACAGGTCTTTGC-3'，扩增片段长约 400bp。以上引物均由上海英骏公司合成。

三、结果判断

（1）β-actin 内参基因

β-actin内参基因的PCR扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像仪照相分析。DNA样品经PCR扩增后产生400bp左右片段为β-actin基因阳性,而无相应的扩增产为β-actin基因阴性，阴性标本证实人类细胞基因组提取失败，作为无效样本，不再进一步检测HPV16E6。

（2）HPV16E6 基因

用2%的琼脂糖凝胶电泳检测HPV16E6基因的PCR扩增产物，凝胶成像仪照相分析。DNA样品经PCR扩增后产生大约400bp片段为HPV16E6基因阳性,而无相应的扩增产物为HPV16E6基因阴性。

（3）扩增产物的回收与纯化

以手术刀片切下含目的片段（HPV16E6）的凝胶，放入1.5ml微量离心管，用核酸纯化试剂盒回收DNA片段，操作步骤严格按照OMEGA胶回收试剂盒说明书进行。

①切胶:切胶时，紫外线照射时间最好不超过30s，以避免DNA的降解。尽量切除多余的凝胶。

②将切下的胶块放入经高压灭菌处理的1.5mlEP管中，并称其重量，按照lg/ml的标准加入BindingBuffer，然后在55℃-60℃的水浴10min，并每隔2-3min摇动EP管直到胶完全融化。

四.总结与展望

尿液自我取样过程简单、快捷、无创，耗时短，减少疼痛，基于尿液标本进行HPV检测有很多的优势，可以弥补现有筛查策略与实际需求之间的缺憾。虽然目前在尿液的取样、保存、扩增和检测等方便仍然缺乏规范、准确的流程，但是，国内外已经开展相关研究。现有研究提示基于尿液标本进行HPV检测有望应用于宫颈癌筛查，与现有筛查策略互相补充，提高宫颈癌筛查的覆盖率及可行性，或应用于流行病学和HPV疫苗效果监测研究工作。更早发现，更早治疗，守护女性宫颈健康。

参考文献：

[1]赵恩锋,鲍媚,李超,等.50年宫颈癌的发病趋势和临床特点分析[J].第一军医大

学学报. 2005, 25(6): 605-609.

[2]]章文华主编.子宫颈病变的诊治要点[M].人民卫生出版社,2006,12 (1): 7-8.

作者简介：

1.王庆帝（2003.7—），女，黑龙江省大庆市，专科在读，研究方向：基础医学。

2.通讯作者：曲媛媛（1985.1—），女，汉族，山东威海，硕士研究生，副教授，研究方向：基础医学。