代谢组学在结直肠癌标志物发现中的应用

 代谢组学在结直肠癌标志物发现中的应用

周燕飞1 ,葛昊2 ,王瑜3  ,樊志敏（通讯作者）

南京中医药大学

摘要： 结直肠癌是人消化系统最常见的一种高发恶性肿瘤，提高对结直肠的预防，早期更加高效便捷的发现是目前面临的挑战之一，本文主要通过对近两年来基于代谢组学取得的在诊断方面的研究进展，主要以论述可能的生物标志物，以及如何高效，低价，损伤小的更好诊断，包括通过血液检查，尿液检查，粪便检查等来取得较为准确且病人痛苦小，取样方便的方式，基于此类目的，论述目前在结直肠癌的早期诊断相关方面已经取得的相关的学术进展。

关键词：结直肠癌，代谢组学，粪便，尿液

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是人消化系统最常见的一种高发恶性肿瘤，据2020年国际癌症研究机构评估显示，结直肠癌目前预估在发病率方面排名第三，但在死亡率方面却是排名第二[1]。在我国，CRC的发病率和死亡率分别为第二位和第五位[2] ，整体来看，目前都是高于国际水平，且在我国由于饮食结构问题，摄入加工肉类较多，且因为生活水平提高，带来高发的糖尿病，肥胖等危险因素，还有一直以来的吸烟，中国饮酒文化带来的大量饮酒，导致我国结直肠癌发病率居高不下，远超欧美等发达地区，但是近两年来，我国结直肠癌的五年生存率开始较前略有回升[3]，主要依赖于医疗技术的提升，以及早期筛查结直肠癌的手段较之前几年的普及，顺势带来的早发现早治疗。参考2020年中国结直肠癌筛查与早诊早治指南[4] ，虽然指南中提出肠镜作为第一顺位的筛查手段，但实际上较之欧美在推行过程中仍存在很多困难（肠镜为侵入性有创操作，不适感强烈，目前即使有麻醉手段辅助的情况下仍存在很多人拒绝行肠镜检查的情况，由于我国仍处在发展转型阶段，因经济困难而拒绝行肠镜检查的情况仍较多）。而指南推荐的其他检验检查项目如：免疫法粪便隐血试验（FIT）,乙状结肠镜，结肠 CT 成像技术，多靶点粪便 FIT-DNA检测，肿瘤指标等皆因敏感度不够，特异性不高，影响因素多，检查条件等而导致检验阳性率不高，发现不及时，从而导致延误诊断治疗，从而进一步影响预后，导致患者生存率下降，死亡率升高。为此，各种针对CRC的检测手段在医疗工作者的不懈探索中，目前已经取得了一定的进步。其中代谢组学起到积极的作用，本文主要论述目前在结直肠癌的早期诊断相关方面已经取得的学术进展。

1. 代谢组学的学科含义

[代谢组学是将生物体作为一个动态的整体研究其内因或外因导致的代谢变化，是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学][5]。主要是通过对小分子代谢物的变化研究，从而达到系统或整体上地进行检测、量化和编录生物内源性代谢物质，掌握其中的变化规律，并根据这些规律联系其与所发生的生物学事件或过程的本质。代谢组学相较于其他组学不仅仅是对于机体本身的研究，更是对于机体内部的相互作用，互相联系的机体与机体之前的相互作用的研究，故而不论细胞、组织或者生物机体整体甚至其之间的相互作用都可以作为其研究对象。从而进一步扩展了可研究的方向，从单纯的自古华山一条道变成了条条大路通罗马，进一步扩展了可研究性，为进一步发现结直肠癌的新型检测手段提供了新的指导思路。

2. 代谢组学的研究方法

[代谢组学的研究方法中主要是针对相对分子量≤1 500 的小分子代谢物，这些小分子代谢物包括常见的代谢物质，如糖类，氨基酸，脂质等，由于代谢物质的化学结构多样性，研究对象通常较为复杂，对于相关数据的分析也存在众多影响因素，需要通过严格的实验设计后进行多变量深度数据分析，因为数据分析工作量大，分析复杂，需要的技术也多种多样，目前常用的化学技术主要包括核磁共振波谱法（NMR）和质谱法（GC-MS；LC-MS）等，因为技术的多样性，使得每一种技术都具有相关的优势和适用范围。]

2.1 核磁共振波谱法

优势： 相对较高的可重复性、易于识别的代谢物、高通量和非破坏性的样品处理[6]。NMR对于检测对象预处理的要求较低或无需处理，且稳定性较好。基于NMR的代谢组学允许对生物标志物进行多维分析，有利于在复杂的生物流体中对代谢物进行明确的分配与量化，提高检测效率。

缺点方面：尽管目前核磁共振技术不断进步迭代，但是在对于复杂样本时，由于成分复杂，信号重叠易相互干扰，导致特异性较低，且检测成分时灵敏度欠佳，易导致信息缺失。

2.2质谱法

优势：灵敏度好，选择性好，特异性强，可以同时检测大量代谢物，且基于庞大的检索数据库，使得更多的代谢成分能够被发现。而且质谱法可以通过调整不同前处理方法、多种色谱

分析条件（正相、反相）、不同离子化方式（ESI，APCI）的高分辨质谱非靶向扫描等多个分析策略相[7]组合以及高灵敏度的靶向检测方法，有助于提高检出。在各种代谢组学技术中，包括GC/MS、核磁共振（NMR）、高性能代谢组学技术。代谢组学技术包括GC/MS、核磁共振（NMR）、高效液相色谱/质谱（HPLC/MS）和傅里叶变换红外（FT/IR）等。GC/MS是一种强大的代谢组学工具，基于其高灵敏度、峰值分辨率和重现性，被广泛用于代谢物的鉴定。

缺点：样品前处理要求较高，如未能正确处理样本，会导致代谢物不能被检测出，影响结果。并且即使是在目前科技技术进步的情况下，部分代谢物的浓度也存在不再检测范围内，或者存在超出检测范围的情况，导致检测出现误差。

综合上述优缺点可知悉，我们目前的常用的相关代谢组学手段并不能达到全方面覆盖的情况，我们需要通过多种手法并行，达到完善相关检测，或在相关代谢物中进行更细致的分类筛选，选择适合的代谢组学技术手段，在缩减工作量的同时达到更好的检测效果，对于结直肠癌相关预测的筛检更是需要从多方面，多角度来发现特异性及敏感性都高的相关代谢物。

3. 代谢组学在CRC早期诊断中的应用及进展

我们研究CRC代谢组学的意义是通过在代谢组学的研究发现有意义的代谢物差别或发现新的代谢通路，识别和开发新的生物标志物用于CRC的早期诊断，或用于指导改善临床治疗，并使其成为一种新的治疗方法。

3.1CRC在粪便中可能存在的有意义标志物

结直肠作为粪便的存储与运输器官，在粪便中进行结直肠癌的早期诊断的探索具有极大的意义，粪便中可能掺杂肠道脱落细胞，可能存在肿瘤导致的菌群变化等，粪便还是生物代谢的产物，基于粪便的特殊性，诸多研究对此进行了研究，Marc Clos-Garcia[8]等人通过对224份粪便样本进行了UHPLC-MS分析和16S微生物组分析的组合进行分析后发现：1）粪便中胆固醇酯和鞘脂水平的差异；2）梭状芽孢杆菌、副黏液杆菌和葡萄球菌有所增加， Lachnospiraceae家族则有所减少；Minsuk Kim[9]等人通过 UPLC-MS/MS 平台对进展型腺瘤102例、对照组102例以及CRC组36例的粪便样品进行非靶向代谢组学分析发现，包括多不饱和脂肪酸、次级胆汁酸和鞘氨醇类的几种生物活性脂类提供了发现可能致癌的早期事件。Sayaka Mizutani[10]通过CE-TOF-MS和全基因组鸟枪法基因组测序对CRC致癌的多步骤过程进行分析后发现1）粪便支链氨基酸、苯丙氨酸和pheC有可能成为非侵入性诊断标志物。2）细菌（如F. nucleatum）和微生物代谢物（如DCA）在CRC发病时增加，并且其中A. parvulum和A. odontolyticus在癌变的早期表现出明显的增加。Rashmi Sinha[11]等人通过HPLC-GC/MS-MS 对CRC病例分析发现变形菌和放线菌具有很强的微生物-代谢物相关性。James J Goedert[12]等人通过HPLC-GC/MS-MS (Metabolon, Durham, NC) 对冻干粪便样本分析发现粪便中许多小分子（如血红素和肽）的不同阵列的差异可能有助于早期诊断。Yongzhi Yang[13]等人通过GC-MS技术对100名实验对象（CRC=50,健康状态=50）的粪便进行分析后发现尸胺、腐胺是区分CRC与健康状态的潜在生物标志物。上述几个实验可以发现目前主要相关的代谢组标志物以脂类相关性代谢物为主，另外一些相关性的早期发现研究与肠道中的细菌相关。在粪便相关组学的相关研究中，各类代谢物都有相关涉及，这些生活直至的代谢物主要是提供了CRC的鉴别意义，对于致癌早期的发现其实尚未给出明确的代谢物指导，肠癌的发生早起为腺瘤，对于腺瘤的鉴别特异性不够，另外一部分实验提供了肠道菌群的改变或者迁移带来的肠道生态改变，虽然Daniel R Garza[15]等的实验并未明确发现驾驶菌群，但是乘客菌群的发现为发现驾驶菌群提供了指导意义，目前发现的可疑驾驶菌群也为我们进一步明确指导了前进方向，肠道菌群的明确也会为检测提供性价比更高的敏感检测项目，为结直肠癌的早期筛查更进一步提供方便快捷且无创的检查方式。

3.2 CRC在尿液中可能存在的有意义标志物

尿液作为人的重要代谢手段，具有取样方便快捷，即时性强等在研究中具有极大的探求意义。Zhening Wang[16]等人对一个55 CRC患者和40健康对照组的尿液OPLS-DA，NMR分析后发现在区分早期CRC组和健康对照组方面，丙氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸和乙酰乙酸酯联合使用比任何单一代谢物都具有更好的诊断能力，敏感性、特异性。Yan Ni[17]等人通过对一个关于64个正常人和患者之间的血，尿，组织的MS，NMR分析中发现，其中一个尿液中的代谢物标记物小组，包括柠檬酸盐。 海马酸盐、对甲酚、2-氨基丁酸盐、肉豆蔻酸盐、腐胺和犬尿氨酸，能将CRC患者与健康对照组区分开来。 Eun Ran Kim[6]等人通过(CRN：36例晚期腺瘤患者和56例结直肠癌患者，共计92例)和健康对照组（n=156）通过NMR获取数据分析后得出牛磺酸（AUC 0.823），丙氨酸为（AUC 0.783），3-氨基异丁酸为（AUC 0.842）被认为是CRN患者的良好鉴别指标。尿液中的相关分析中发现，尿液中的标志物种类较多，且相关指标兼备晚期腺瘤患者的发现，尿液的取样要求低，且患者取样即时性较强，取样无创，检测方便快捷，且标志物较多，为选择最敏感特异指标提供了较大的选择范围，有利于发现早期鉴别指标。

3.3 CRC在血液分析中发现的可能意义

血液检测是目前发现肠道肿瘤的重要手段，但是目前消化道相关指标CEA、CA199、CA125、CA724等在对于肠道恶性肿瘤的检测中，存在早期敏感性不高，中晚期特异性不高等情况，出现明显升高时提示肿瘤可能，但此时患者已到中晚期，导致预后欠佳。Ran Liu[18]等人在一项CRC大鼠血液研究中发现血浆中的琼脂糖和γ-氨基丁酸的水平升高以及腐胺和精胺的水平降低可作为CRC早期阶段的生物标志物，需强调的是同时测定这四种物质在早期诊断中非常重要，有助于提高了诊断特异性。这项研究为提高诊断特异性提供了更为明确的方向。Jinping Gu[19]等人通过1 H-NMR分析发现谷氨酰胺、琥珀酸、甘油、天冬氨酸和乳酸的不同代谢物是结肠息肉潜在的生物标志物；乳酸、甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和天冬氨酸的不同代谢物是CRC潜在的生物标志物。为早前诊断，减少多次肠镜痛苦也存在极大的意义；Hai-Ning Liu[20]等人通过(GC/MS )分析后发现得出miR-21、miR-29a、miR-92a和miR-125b的组合具有最高的曲线[21]下面积，为早期诊断提供了更多的生物标志。Fan Zhang[22]等人通过UHPLC-QTOF/MS对已鉴定的血源性代谢生物标志物在CE患者的CRC监测中表现出优于常用的临床生物标志物（CEA 和 CA19-9）的特性。Nurul Azmir Amir Hashim[23]等人通过LC-QTOFMS 技术发现与正常对照组血清相比，CRC患者的存在显著的11种差异代谢物，且经新组验证后准确率约80%，其中7种代谢物作为生物标志物表现出很高的敏感性和特异性。从上述实验中可以看出，血液检测方便快捷，是目前最常使用的检测手段， CEA 和 CA19-9存在特异性较低的缺点可因此得到弥补，可联合监测相关指标，但同时多项检测可能存在价格高昂等情况，需要进一步进行发现。

4. 总结

目前的相关研究中，可看出在患者的血，尿，粪，组织等相关比较中均可以发现相关的早期诊断指标，大多数指标对于明确分辨正常人和结直肠癌患者的准确性较高，这为我们进一步进行相关检测提供了指导思路，这些指导性实验充分为我们进一步明确其中的敏感且特异性高的指标提供了大方向，有利于缩小研究范围，存在进一步减轻经济负担的可能，我们的前人在不懈的探索，我们乘着前人的东风在早期诊断上进一步不懈探索，正是因为有这些不懈的努力探索，我们才能逐步降低结直肠癌患者的死亡率，随着人们生活品质的进一步提高，总是会有很多疾病的危险因素被逐渐提高，但是我们牢牢地掌握发现的手段，最终总会柳暗花明又一村。

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2021年省级重点研发计划（社会发展）专项资金项目表，BE2021611

[代谢组学是将生物体作为一个动态的整体研究其内因或外因导致的代谢变化，是关于生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律的科学] 

[代谢组学的研究方法中主要是针对相对分子量≤1 500 的小分子代谢物，这些小分子代谢物包括常见的代谢物质，如糖类，氨基酸，脂质等，由于代谢物质的化学结构多样性，研究对象通常较为复杂，对于相关数据的分析也存在众多影响因素，需要通过严格的实验设计后进行多变量深度数据分析，因为数据分析工作量大，分析复杂，需要的技术也多种多样，目前常用的化学技术主要包括核磁共振波谱法（NMR）和质谱法（GC-MS；LC-MS）等，因为技术的多样性，使得每一种技术都具有相关的优势和适用范围。]