转录组测序分析胫骨横向骨搬移对糖尿病足外周血mRNA表达改变

转录组测序分析胫骨横向骨搬移对糖尿病足外周血 mRNA表达改变

苏宏杰 花奇凯通讯作者

广西医科大学第一附属医院骨关节外科

【摘要】目的 通过外周血测序分析胫骨横向骨搬移术后糖尿病足患者mRNA表达改变。方法 通过RNA采血管抽取糖尿病足患者胫骨横向骨搬移术前与术后的外周血，用于mRNA的测序。利用数据库进行KEGG通路富集和GO生物学过程分析，蛋白-蛋白互作网络分析。最后利用Cytoscape筛选核心基因。结果 通过筛选发现差异表达的mRNA共计421个，这些基因主要富集在自然杀伤细胞毒性、造血细胞谱系等通路，以及中性粒细胞的激活等生物学过程中。筛选确定了CAMP、CCL4、CD274、CD8A、ERBB2、ZMA、GZMB、ITGB3、KLRC1、KLRD1、KLRK1、LTF、TBX21 等候选核心基因 结论 胫骨横向骨搬移后外周血中的mRNA表达发生了改变，差异表达基因主要与中性粒细胞和自然杀伤细胞相关，提示了固有免疫在促进创面愈合的潜在机制。

【关键词】 转录组测序；胫骨横向骨搬移术；生物信息学分析；

基金项目：广西重点研发计划（2021AB11027）；青秀区科技计划（81373498）广西医科大学第一附属医院临床研究攀登计划（YYZS2020010）

前言

糖尿病足溃疡是糖尿病微血管病变的并发症之一，治疗周期长，患者治疗花费巨大 [1]。而及时有效的治疗是避免截肢至关重要的一步。糖尿病造成的高血糖环境是是内皮损伤的重要诱因。由于糖基化产物的堆积，氧化应激损伤，和巨噬细胞的M2极化障碍等导致的长期慢性炎症，从而造成血管内皮衰老和血管生成能力下降，造成伤口不愈合[2]。在一项回顾性分析当中，患者经过胫骨横向骨搬移（Tibial Transverse Transport，TTT）治疗，足溃疡治愈率达96%。而在术后3个仍然发现足底有较高的血流灌注，初步证明其临床有效性[2]。

经TTT治疗发现血管的增生和缺损组织的修复[3]。由此做出猜想，在完成搬移调节周期后，由于近端的骨搬移作用，激发了远端足部组织修复的潜能，创造了一个愈合的良好局面。转录组测序可以快速地获取在特定状态下的组织或器官的大部分转录信息。而糖尿病足患者在骨搬移治疗中外周血的mRNA表达变化情况尚未有见报道。为此我们通过外周血的RNA测序，为后续的研究提供方向。

资料与方法

一般资料 选取患者诊断为2型糖尿病足（n=3），且无肝脏、肾脏基础病，无采血禁忌症。本研究遵守赫尔辛基宣言有关的伦理要求，已经获得广西医科大学第一附属医院伦理委员会的批准（证书编号：2021KY-E-305）。已告知受试患者本研究内容，并签署知情同意书。

实验方法

胫骨横向骨搬移术治疗：在胫骨中上端1/3处，用截骨器5cm×1.5cm的长方形截骨区后置入胫骨横向骨搬移外固定装置，下肢创面行清创治疗处理，只清创不扩创[4]。胫骨横向骨搬移外固定装置调节方法为，调节螺母使骨块发生上抬或下降，每天移动距离为1mm。调节周期结束之后拆除外固定装置。术后每日进行伤口换药。换药时使用0.9%生理盐水进行冲洗，清洁敷料包扎。包扎时采用减压包扎，即用湿性状态蓬松纱布包扎，减少对足部溃疡部位的压迫。出现继发坏死时及时清创处理。

临床样本收集：经过胫骨横向骨搬移术治疗前后，用RNA 采血管（BD，美国）进行全血RNA保存收集。取样时间为手术前一天和术后完成骨搬移调节时即30天后。每份样本采集约2.5ml静脉血，采血管中包含7.5ml RNA保存液。采集完毕上下颠倒混匀，转移至-80℃冻存，用于外周血RNA测序。主要步骤大致包括对血样本进行总RNA的提取，转录组文库的制备，上机测序以及原始数据的处理。

差异表达分析：差异分析目的在于是筛选出两组样本中表达变化明显的mRNA。当差异倍数（Flod Change）大于2，即|log₂FC|＞1且P＜0.05时被认为是差异显著的基因。

功能富集分析：利用cluster Profiler软件进行GO生物学过程（Gene Ontology Biological Process）的注释和京都基因和基因组通路（KEGG pathway）富集分析。统计指标包括富集评分（Enrichment Ratio），富集的基因数目（Size），以及差异显著性 -log10（pValue）。通过功能富集分析可以推测所筛选的差异基因的生物学功能。

蛋白-蛋白互作网络分析：利用在线数据库STRING（https://string-db.org/）进行蛋白-蛋白互作网络分析。

核心基因预测：将获取的节点信息导出为csv格式，再导入Cytoscape软件进行节点计算，利用MCODE插件筛选出核心集群，结合CytoHubba插件利用NCC算法计算节点评分高的基因，取两者交集。

统计分析 利用R软件（3.6.1）中的DEseq2包进行差异表达分析。利用R软件中的ggplot2包对分析结果进行可视化分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1. mRNA的差异表达情况：

图 1 差异表达mRNA的可视化。 A. 火山图，蓝色代表差异显著且表达下调的基因；B.层次聚类热图，反映不同样本之间的差异基因的表达情况。蓝色代表下调，红色代表上调

经过DEseq2软件计算，|log₂FC|＞1且P＜0.05时筛选出差异表达的mRNA共计421个，其中术后相较于术前发生上调的有258个，下调的有163个。对所有产生表达的mRNA进行了火山图的可视化分析（图1 A），选取差异显著的|log₂FC|＞1且Adj.P＜0.05时的mRNA进行了层次聚类热图分析。（图1 B）。术后相较于术前，外周血中发生了部分mRNA的表达改变。

2. KEGG通路和GO生物学过程富集

KEGG通路富集分析发现，这些差异基因主要富集在自然杀伤细胞（NK cell）介导的细胞毒性作用、抗原的呈递和加工、金黄色葡萄球菌的感染以及造血细胞谱系等通路上。和GO生物学过程富集分析发现与中性粒细胞相关，包括中性粒细胞脱颗粒、中性粒细胞在免疫反应中的激活等。

图 2 A. 所有差异基因KEGG通路富集情况；B. GO生物学过程中富集最显著的前20个条目。圆点大小代表了富集在该通路或者GO注释中的基因数目，数目越大，圆形越大；颜色深浅代表了P值大小，颜色越深代表了差异越显著；GeneRatio表示这些基因在该通路或者GO注释条目中富集程度，数值越大，富集程度越高。

3. PPI互作网络构建和核心基因筛选

将

图 3 A, B.经过MCODE计算获得两个核心基因簇，绿色表示上调，红色表示下调；C经过Cytohubba计算获得节点评分前15基因，颜色越深代表节点中心性越高

差异显著的mRNA对应的Gene symbol输入到STRING数据库中，选择多蛋白分析。将MCODE筛选获得的两个基因簇（Cluster1、Cluster2）和由CytoHubba插件的Degree评分获得的前15个节点的基因取交集，共计获得13个基因，分别为CAMP、CCL4、CD274、CD8A、ERBB2、ZMA、GZMB、ITGB3、KLRC1、KLRD1、KLRK1、LTF、TBX21，均为上调的基因。将这些所得基因作为候选研究基因。

讨论

通过对这些差异基因的生物信息学分析，发现主要与NK细胞和中性粒细胞相关。在伤口的愈合过程中，NK细胞起到清除坏死组织和细菌的作用，为肉芽的生长提供适宜的环境[5]。­在筛选出的候选基因中，上调的GZMB基因与NK细胞分泌释放颗粒酶的表达相关，从而启动细胞凋亡等过程[6]。CD8A的表达与 NK细胞结合多种靶细胞相关，从而起到清除感染细胞和肿瘤的作用[7]。CCL4基因的编码与调节趋化因子和炎症反应密切相关[8]。这些基因多数与固有免疫相关，并与功能富集分析结果互相印证。提示了固有免疫在手术后促进伤口愈合的重要作用。

参考文献

1. ZHANG P, LU J, JING Y, et al. Global epidemiology of diabetic foot ulceration: a systematic review and meta-analysis (dagger)[J]. Ann Med, 2017,49(2): 106-116.

2. CHEN Y, KUANG X, ZHOU J, et al. Proximal Tibial Cortex Transverse Distraction Facilitating Healing and Limb Salvage in Severe and Recalcitrant Diabetic Foot Ulcers[J]. Clinical Orthopaedics and Related Research, 2020,478(4).

3. NIE X, KUANG X, LIU G, et al. Tibial cortex transverse transport facilitating healing in patients with recalcitrant non-diabetic leg ulcers[J]. J Orthop Translat, 2021,27: 1-7.

4. HUA Q, ZHANG Y, WAN C, et al. Chinese Association of Orthopaedic Surgeons (CAOS) clinical guideline for the treatment of diabetic foot ulcers using tibial cortex transverse transport technique (version 2020) [J]. Journal of Orthopaedic Translation, 2020,25: 11-16.

5. LIU S, GALAT V, GALAT Y, et al. NK cell-based cancer immunotherapy: from basic biology to clinical development[J]. J Hematol Oncol, 2021,14(1): 7.

6. CAMPOS T M, NOVAIS F O, SALDANHA M, et al. Granzyme B Produced by Natural Killer Cells Enhances Inflammatory Response and Contributes to the Immunopathology of Cutaneous Leishmaniasis[J]. J Infect Dis, 2020,221(6): 973-982.

7. ZHOU S, LU H, XIONG M. Identifying Immune Cell Infiltration and Effective Diagnostic Biomarkers in Rheumatoid Arthritis by Bioinformatics Analysis[J]. Front Immunol, 2021,12: 726747.

8. CHANG T T, CHEN J W. Direct CCL4 Inhibition Modulates Gut Microbiota, Reduces Circulating Trimethylamine N-Oxide, and Improves Glucose and Lipid Metabolism in High-Fat-Diet-Induced Diabetes Mellitus[J]. J Inflamm Res, 2021,14: 6237-6250.

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