禽流感免疫抗体监测与分析

禽流感免疫抗体监测与分析

帕提古丽 ·阿伍提

新疆喀什地区疏勒县畜牧兽医站（ 844200）

摘要：为切实做好我县禽流感等重大动物疫病防控工作，促进畜牧业增产、增效、农民增收，持续巩固我县脱贫成果，根据疏勒县防治重大动物疫病指挥部办公室文件（2020）18号文件要求，9月20日之前免疫过家禽、2020年10月10日至10月20日期间在县畜牧兽医局组织人员分到三个组对15个乡（镇）开展了秋季重大动物疫病集中免疫效果检查、每个村采集家禽样品各5份、总血清1500份、进行了重大动物疫病免疫效果随机抽样监测。禽流感免疫抗体效价结果显示如下：全县15个乡（镇）禽流感免疫抗体平均合格率为81.7%，免疫抗体合格率达到了国家合格标准。

关键词：鸡；禽流感；免疫抗体

前言：

高致病性禽流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的以禽类为主的烈性传染病，发病率和死亡率很高，危害严重，呈世界性流行，近年来我县也有本病发生，且日趋严重，给养禽业造成了巨大的经济损失。我国将其列为一类重大动物疫病。

流行病学诊断 ： A型流感病毒能感染多种家禽和野禽，流行情况因毒株和动物种类而异，家禽中火鸡最易感。本病可经多种途径传播，如消化道、呼吸道、破损的皮肤黏膜等。一般发病率高，死亡率低，但高致病力毒株感染时，发病率、死亡率均可达到100%。

临床症状：常见症状有：病鸡精神沉郁，饲料消耗量减少，消瘦；母鸡的就巢性增强，产蛋量下降；轻度直至严重的呼吸道症状，包括咳嗽、打喷嚏和大量流泪；头部和脸部水肿，神经紊乱和腹泻。
另外，禽流感的发病率和死亡率差异很大，取决于禽类种别和毒株以及年龄、环境和并发感染等，通常情况为高发病率和低死亡率。在高致病力病毒感染时，发病率和死亡率可达100%。

免疫程序:疏勒县散养家禽3月，9月份进行免疫，规模场和大户按农业部下发的免疫程序进行免疫。

免疫对象:鸡、鸭、鹅、鸽子。疫苗种类:含流感、新城疫重组二联活疫苗;合流灭活苗。

技术要点

1、疫苗在使用前必须冷藏或冷冻保存。

2、凡注射免疫的注射部位必须先消毒、再注射疫苗。

3、注射的弱毒二联苗疫苗必须按照疫苗说明书的要求用生理盐水进行稀释。

4、免疫时严格根据疫苗说明书的要求进行，必须足剂量免疫。灭活苗：鸡0.5ml/羽，鸽子0.25ml/羽；弱毒二联苗(冻干苗)：鸡1头份/羽，0.5头份/羽。颈部皮下或胸部肌肉注射。点眼、滴鼻0. 05m1/羽。

5、必须做到1羽1针头，防止针头传播疫病。

6、凡涉及禽产品出口的家禽都使用灭活苗免疫；除了规模饲养的肉鸡和鸽子采用饮水免疫外，其它禽一律采用种组二联苗注射免疫；凡采用饮水免疫的，须免疫前半天以上停止饮水后，再剂量翻2～3倍饮水免疫，确保鸡群整体免疫水平。

7、所有免疫家禽必须详细记录家禽的栋舍号、所接种的疫苗种类、批次、疫苗名称，免疫日期、免疫剂量。

8、疫苗一经开瓶后，4小时内必须用完，否则报废处理。使用完的空疫苗瓶、过期和失效的疫苗统一回收登记，统一销毁。

监测时间:集中免疫21天后各县(市)自行开展免疫抗体效价监测工作。

免疫效果监测及判定标准:

(1)所有应免家合免疫密度要求达到100%;

(2)免疫抗体效价(H5)试验1≥24判定为合格;

(3)免疫禽辞平均免疫抗体合格率达82%以上。

注意事项:认真落实消毒制度,尤其是大型养殖场和养殖大户,防止疫情发生,同时做好消毒记录。

实验步骤：

一、材料和方法

（一）血清及病料样本

使用离心机分血清1500分，保存2℃-8℃、进行免疫抗体检测。

（二）材料准备

要准备一次性96孔V型微量反应板，微量移液器、吸头、阿氏(Alsevers)液，鸡红细胞悬液， pH7.2值0.01 mol/L PBS。 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型血清以及阴性血清。

（三）检测依据：

H5亚型禽流感血清学检测血凝抑制试验（禽流感抗体HA-HI试 验）操作方法和判断标准严格按照操作技术执行 “高致病性禽流感防治技术规范、高致病性禽流感诊断技术GB/T18936-2003”标准进行。

各种配制液的配制方法：

★为PH 7.4 0.01MOL／L PBS的配制方法 ：

氯化钠 （NaCl） 8g

氯化钾 （KCl） 0.2g

磷酸二氢钾 （KH2PO4） 0.2g

磷酸二氢钠 （NaHPO4.12H2O） 2.9g

蒸馏水 1000㏕（毫升）

PBS配了以后112磅20分钟高压灭菌。

★用红细胞保存液（阿氏液）配制：

蒸馏水 100㏕ 200㏕ 1000㏕

葡萄糖粉 2.05g 4.1g 20.5g

柠檬酸钠 0.8g 1.6g 8g

柠檬酸 0.055g 0.11g 0.55g

硫化钠 0.42g 0.84g 4.2

过滤分装高压10磅10分钟PH 6.1-6.2 。

★ 1%红细胞配制以前， PH7.2 0.01MOL/ L PBS配制：

（1）25MOL/L PBS 配制：（使用禽流感监测PBS）

磷酸氢二钠 NaH2PO4.12H2O 2.74ɡ

磷酸二氢钠 NaH2PO4. 2H2O 0.79ɡ

蒸馏水 100㏕

（2）①1MOL PBS取25 MOL PBS 40㏕

② 加 氯化钠 （ NaCl ） 8.5ɡ

③ 加 蒸馏水 960㏕

★1%红细胞配制法：

采集5只未进行过任何免疫过的成年公鸡血液、采血完毕后好与阿氏液混合，分装至13ml容量的离心管，经2000~3000r/min，5~10min，并丢上液和红细胞上层的白细胞薄膜，再加入十倍以上血量的PBS液，上下缓慢颠倒，使其充临分混匀，再离心弃去上清液，反复几次直至上清液清亮透明为止。1 mL清液加99毫升阿氏液配成了1%红细胞100毫升。

（四） 操作方法：

1、血凝(HA)试验(微量法)

在微量反应板的1孔～12孔均加入0.025 mL.PBS，换滴头。 吸取0.025 mL病毒悬液(如感染性鸡胚尿囊液)加入第1孔，混匀。 从第1孔吸取0.025 mL病毒液加人第2孔，混匀后吸取0.025 mL加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025 ml.弃之，换滴头。每孔再加入0.025 mL.PBS。每孔均加人0.025 mL.体积分数为1%鸡红细胞燃液(将鸡红细胞悬液充分摇匀后加人)。振荡混匀，在室温(20℃～25℃)下静置40 min后观赛结果(如果环境温度太高，可置4C环境下)。对照孔红细胞将成明显的钮扣状沉到孔底。

结果判定

将板倾斜，观察红细胞有无呈泪滴状流淌。完全血凝(不流淌)的抗原或病毒最高稀释倍数代表一个血凝单位(HAU)。

2、 血凝抑制(H1)试验(微量法)

根据试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1：256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64(256除以4)。

第一步：微量反应板的1孔～11孔加入0.025 mLPBS，第12孔加入0.05 mL PBS。

第二步：被检血清加入第1孔0.025 ml内，充分混匀后吸0.025 mL于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025 mL弃去。

第三步：1孔～11孔均加入含4HAU 混匀的病毒抗原液0.025 mL，室温(约20℃)静置至少 30 min。

第四步：每孔加入0.025 mL体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，轻轻混匀，静置约40 min(室温约20℃。（若环境温度太高可置4℃条件下进行)，对照红细胞将呈显钮扣状沉于孔底）。

第五步：结果判定

以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为H1滴度。

只有阴性对照孔血清滴度不大于2log：，阳性对照孔血清差不超过1个滴度，试验结果才有效。H1价小于或等于3 log2判定HI试验阴性；HI 价等于4 log2为可疑，需重复试验；H1 价大于或等于5 log2为阳性。（附：图片1）

禽流感H5血凝抑制实验结果登记表

管理编号：CX31/JL05-Q-04-A 编号：

被检单位1 疏勒县疏勒镇 份数 8分 板号01号

被检单位1 疏勒县疏勒镇 份数 8分 板号 02

被检单位 疏勒县疏勒镇 份数 8分 板号 03

2018-2020 年疏勒县 H5 亚型禽流感抗体群体合格率整体呈上升趋势。

3、讨论

根据对疏勒县2018- 2020年连续3年禽流感免疫抗体检测查结果显示，总体抗体合格率呈上升趋势，表明我县禽流感免疫工作在不断的提升。全喀什地区蛋及肉鸡提供的基地。地区畜牧部门的指导、县人民政府的高度重视和县畜牧兽医局干部的努力、乡政府的互相配合、动物村级防疫员的认真开展免疫工作下、本县动物防控工作不断地的完善和提高免疫效价、多年以来没有发生禽流感疫病。为了保障全县人民吃上放心禽类产品，确保家禽业健康发展，近年来,随着我县动物防疫法制建设、防疫措施和防疫机制的不断完善,同时，严格执行“ 政府保密度，业务部门保质量” 的政策，县政府颁布了加大基层防疫队伍建设。