唾液淀粉酶活性测定方法的验证-中国期刊网

唾液淀粉酶活性测定方法的验证

廖昱翔

惠州市综合高级中学高二年级广东省惠州市 516000

摘要：唾液淀粉酶是唾液蛋白的重要组成部分，并且唾液淀粉酶的活性是反映自主神经系统最为灵敏的指标，具有较高的应用研究价值。本文主要讨论了影响唾液淀粉酶活性的常见因素，并使用DNS比色法进行实验测定，验证了测定方法的可行性，为后续研究提供参考。

关键词：唾液淀粉酶；酶活性；DNS比色法

一、前言

唾液淀粉酶（salivary alpha-amylase,sAA）是唾液蛋白的重要组成部分，约占唾液总蛋白的40% ~ 50%^[1]，并且唾液淀粉酶的活性是反映自主神经系统最为灵敏的指标,常用作唾液蛋白分泌的主要指标。交感神经系统与副交感神经系统协调作用于唾液蛋白的分泌^[2]，而唾液淀粉酶活性是交感神经最灵敏的指标。随着技术发展，唾液淀粉酶的活性测定的准确度及可靠性日渐增加，并且常常被运用于中医脾虚证的临床辩证、治疗等方面^[3]。而唾液淀粉酶作为一种生物催化剂，具有专一性和高效性的同时，它相较于常见的化学催化剂更易受外界环境影响，导致其活性下降，甚至失活，为临床研究造成麻烦。本文就对影响唾液淀粉酶活性的因素以及唾液淀粉酶活性测定实验在现有测定方法的基础上进行了探究与讨论。

二、影响唾液淀粉酶活性的因素

1.温度

大多数生物酶的化学本质都为蛋白质，其抗热性较差。在0℃~40℃的温度范围内，酶催化作用速度随着温度的升高而加快。但超过60℃，绝大多数的酶都会失去活性。

2.pH值

酶对环境中的pH十分敏感，只有在一定的pH范围内才能表现出活性，超过这个范围，酶就失活了。一般酶的最适pH在4~8之间。

3.激活剂和抑制剂

有些物质（大多都是离子或者简单的有机化合物），能够抑制酶的活性；有些物质能够增强酶的活性，例如柠檬酸刺激可使唾液淀粉酶活性增加^[4]。

三、实验部分

1. 实验原理

酶是生物催化剂，其催化能力远远超过化学催化剂，并且具有专一性，同一般的催化剂相比，受到温度及pH的影响更大，更易失活。所以本实验在进行酶促反应时，选用的水温为37℃，pH为6.8。唾液淀粉酶（主要含α-淀粉酶）能作用于淀粉中的α-1,4葡萄糖苷键，使淀粉分解为麦芽糖。反应方程式如下：

2 (C₆H₁₀O₅)_n+ 2n H₂O→n C₁₂H₂₂O₁₁

但唾液淀粉酶不能作用于蔗糖分子的α-D吡喃葡萄糖的Cl和β-D-呋喃果糖的C2之间的糖苷键。淀粉的还原性极小，而麦芽糖具有还原性，能使3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂）还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸。据此可以使用DNS试剂，通过还原糖与DNS试剂反应生成的反应液的棕色深浅确定还原糖的含量，在波长540nm处测定溶液的吸光度，便可求出样品中还原糖的含量，从而计算出酶反应的初速度，即酶活力。

材料与试剂

淀粉酶液、可溶性淀粉、3,5-二硝基水杨酸溶液、酒石酸钾钠、磷酸缓冲液（0.2mol/L,pH6.8）、1mg/ml标准麦芽糖溶液、洗瓶、试管架、玻璃棒、水浴锅、分光光度计

实验步骤

3.1唾液淀粉酶的制备

（1）提取：先用水漱口清洁口腔，然后含一小口（约5ml）蒸馏水于口中轻轻漱口1~2分钟。

（2）过滤：将口腔中的酶提取液用一层脱脂棉过滤。

（3）稀释：取滤液1ml，用水定容至50ml，作为淀粉酶的样品。又由于不同人或者同一人不同时间收集到的唾液淀粉酶的活性并不相同，稀释倍数可以是50~300倍，甚至超过。

3.2验证制得的唾液淀粉酶的专一性以及温度对其活性的影响

取3支试管，按下表格中的1#，2#，3#，4#分别进行编号，并依次加入反应试剂，记录反映所观察到的颜色。

/	1#	2#	3#	4#
pH6.8缓冲液(ml)	2	1	1	1
蔗糖溶液(ml)	1	1	0	0
淀粉溶液(ml)	0	0	1	1
唾液淀粉酶液(ml)	0	1	1	0
煮沸过的唾液(ml)	0	0	0	1
酶促反应	摇匀，37℃水浴3min
DNS试剂(ml)	各2
显色反应	沸水浴5min
颜色	黄	黄	棕	黄

由实验现象可得：唾液淀粉酶在高温环境失活，只对唾液有作用，制备的样品合格。

3.3唾液淀粉酶的活性的测定

配置麦芽糖标准稀释液

取6支试管，分别按A1,A2,A3,A4,A5,A6进行编号，将1mg/ml的标准麦芽糖溶液用蒸馏水稀释至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml即为标准稀释液。

	A1	A2	A3	A4	A5	A6
稀释前浓度(mg/ml)	1.0	0.2	0.1	0.05	0.025	0.0125
标准液体积(μL)	200	500	500	500	500	500
蒸馏水体积(μL)	800	500	500	500	500	500
稀释后浓度(mg/ml)	0.2	0.1	0.05	0.025	0.0125	0.0625

（2）取9支试管，按下表中的5#,6#,7#,8-13#分别进行编号，并依次加入反应试剂：

/	5-测定#	6-对照#	7-空白#	标准(8-13)#
pH6.8缓冲液(ml)	1	1	3	2
淀粉溶液(ml)	1	1	0	0
唾液淀粉酶液(ml)	1	0	0	0
煮沸过的唾液(ml)	0	1	0	0
麦芽糖标准稀释液(ml)	0	0	0	A1,A2,A3,A4,A5,A6分别1
酶促反应	摇匀，37℃水浴3min
DNS试剂(ml)	各2
显色反应	沸水浴5min

（3）吸光值测定：

取反应液至1ml玻璃比色皿，测定540nm处吸光值，记为A测定、A对照、A标准和A空白，填入下表

/	5-A测定	6-A对照	7-A空白
A540nm吸光值	1.134	0.429	0.005

计算：ΔA测定=A测定-A对照=0.705，

ΔA标准=A标准-A空白.

标准液浓度(mg/ml）	0.00625	0.0125	0.025	0.05	0.1	0.2
标准液吸光值	0.121	0.136	0.196	0.296	0.458	0.722
A空白	0.005
△标准	0.116	0.131	0.191	0.291	0.453	0.717

以0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625mg/ml标准稀释液浓度为横坐标（x），以其对应的ΔA标准为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=3.1318x+0.1101

计算酶活力：

根据溶液浓度与光吸光值成正比的关系，将ΔA测定代入标准曲线的公式中得到x(mg/ml)，即为酶液管中麦芽糖浓度，进而得出本实验中的唾液淀粉酶的酶活力。本实验规定：在37℃、pH6.8的条件下，每3min水解淀粉释放1mg麦芽糖所需的酶量为1个酶活力单位。

所以由ΔA测定=0.705代入标准曲线，得：

C(麦芽糖的浓度）=0.189955 mg/ml，且已知稀释倍数n为50倍，则总活力单位=C×n=9.497733，成功测得样品的酶活性。

4. 实验反思与误差分析

不同温度或pH值的情况下，得到的数据也不同。若温度或pH值并不适宜实验用酶的生存导致其活性下降，将会对实验结果造成影响。唾液淀粉酶存在于人体唾液中，其生活温度接近人体正常体温37℃，pH值接近6.8，故本实验采用如上条件进行实验，避免因酶活性过低而导致测量误差增大。
进行实验步骤3.1（2）时，若将脱脂棉换成滤纸，则可能会导致大量唾液淀粉酶残留在滤纸上，造成唾液淀粉酶活性极低的现象。
提取唾液淀粉酶时口腔含的蒸馏水量、提取唾液时间等因素也可能影响实验结果，应进一步设计实验加以验证。

四、结论

本实验通过使用唾液淀粉酶，催化淀粉水解，麦芽糖为主要的水解产物，使3,5-二硝基水杨酸（DNS试剂）还原成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸。通过麦芽糖与DNS试剂反应生成的反应液的棕色深浅确定还原糖的含量，在波长540nm处测定溶液的吸光度，从而求出样品中还原糖的含量，再计算出酶促反应的初速度，即酶活力。

参考文献

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KUKURUZINSKA M A,APEKIN V,LAMKIN M S,et al.Antisense RNA to the.first N-glycosylation gene ALG7 inhibits protein N-glycosylation and secretion by Xenopus oocytes [J]. Biochem Biophys Res Commun,1994,198(3):1248-1250.
林静，杨泽民.脾虚证患者唾液淀粉酶活性异常机制的研究概况 [J].中外医学研究，2017,15(1):159
陈龙辉，杨泽民，李茹柳，林传权，张杰，陈蔚文.柠檬酸滤纸面积及浓度对刺激健康人唾液分泌和唾液淀粉酶活性改变的影响 [J]广州中医药大学报，2013,30(2):186

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