蒙药材甘草叶中槲皮素和山奈素含量测定研究

蒙药材甘草叶中槲皮素和山奈素含量测定研究

乌云嘎 1,新吉勒格里 2,郝俊生 3*

(1. 通辽市中药产业研究中心 ，内蒙古 通辽市 028000； 2.新疆博尔塔拉蒙古自治州蒙医医院，新疆 833400 ;3. 通辽市市场检验检测中心 ，内蒙古 通辽市 028000）

摘要：目的 测定不同产地甘草中槲皮素和山奈素的含量，为蒙药材甘草叶的质量控制提供参考。方法 色谱柱为Agilent Eclinse XDB- C18（5m，4.6*250mm）；流动相为甲醇-0.5%磷酸水（48:52）洗脱，检测波长360 nm，柱温40℃，流速1 mL·min^-1,进样量10 L。结果 槲皮素在0.367~1.102µg·mL^-1（r=1）、山奈素在0.137~0.411µg·mL^-1（r=0.9998）范围内与峰面积呈良好的线性关系；其平均回收率（n=9）分别为97.29（RSD5.76%）和92.68（RSD3.03%）；7批次甘草叶药材中槲皮素和山奈素平均含量分别为0.361%和0.115%。结论所建立的甘草叶中槲皮素和山奈素含量测定方法操作简便、稳定可靠、重复性及准确度较好，可为甘草叶质量控制提供参考。

关键词：蒙药材；甘草叶；槲皮素；山奈素；含量测定

甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根茎^[1]，从而地上部分资源一直被浪费。甘草属植物分布较广，全球约30余种，我国分布最多，约有18种^[1,2]，内蒙古鄂尔多斯，具有丰富的植物资源，享有“中国甘草的故乡”之美誉，其中乌拉尔甘草最具代表性^[3]，据蒙医古籍文献记载甘草叶为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥叶子，具有清热功能，主治协日热引起的咽喉肿痛，嗓子干热，声音嘶哑。近些年为了促进甘草属地上部分有效利用近年来对其进行了研究，甘草叶也被独立研究后发现主要成分为黄酮类成分，有抗肿瘤，抗凝血抗血栓，抗前列腺炎等药理作用，但质量控制方面无文献报告。故本研究以采集内蒙古地区内甘草叶，以甘草叶中主要黄酮类成分槲皮素和山奈素为对照品，为甘草叶的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1. 1. 仪器

Agilent 1260 Infinity高效液相色谱仪（美国），Agilent 1260LC 化学工作站；Mettler Toledo NewClassic MS105电子天平 d=0.01 mg （梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；Milli-Q Academic超纯水系统（法国）；赛多利斯科学仪器（北京）有限公司，型号：SQP 电子天平；数控超声波清洗器 型号：KQ-600DB型（昆山市超声仪器有限公司）；色谱柱：Agilent Eclinse XDB- C18色谱柱（5m，4.6*250mm）。

1.2 试药

槲皮素对照品（含量测定用，99.1%），批号100081-201610，中国食品药品检定研究院提供。山奈素对照品（含量测定用，93.8%），批号110861-201812，中国食品药品检定研究院提供。采集7批甘草叶药材（表1），原植物由内蒙古民族大学蒙医药学院教授布和巴特尔鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥叶子。

表1 甘草叶药材来源及甘草叶中槲皮素和山奈素的含量%

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclinse XDB- C18（5m，4.6*250mm）；流动相为甲醇-0.5%磷酸水（48:52）洗脱，检测波长360 nm，柱温40℃，流速1 mL·min^-1,进样量10 L。 色谱图见图1。

图1 槲皮素（A）、山奈素（B）和供试品（C）溶液的色谱图

2.2 对照品溶液的制备：取槲皮素和山奈素对照品适量，精密称定，加80%甲醇制成每1mL含0.074 mg和0.029 mg的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备：取本品粉末2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，在称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀，虑过。精密量取续滤液25 mL，精密加入盐酸5 mL，置90℃水浴中加热水解1小时，取出，迅速冷却，转移至50 mL量瓶中，用80%甲醇稀释至刻度，摇匀，虑过，取续滤液即得。

2.4 线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液5.0 µL、7.5µL、10 µL、12.5 µL、15.0 µL，注入液相色谱仪，测定其峰面积值。以对照品溶液的进样量质量浓度C（x）为横坐标，峰面积积分值A（y）为纵坐标进行线性回归得，槲皮素标准曲线方程为：y = 4069x-2.6064，相关系数ｒ=1，0.367~1.102µg·mL^-1范围内线性关系良好；山奈素标准曲线方程为：y = 4346.4x+17.931，相关系数ｒ=0.9998，0.137~0.411µg·mL^-1范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验：精密吸取X1供试品溶液各10µl，分别连续注入液相色谱仪6次，测定其峰面积值A，并统计分析。结果槲皮素和山奈素RSD依次为0.428%和0.205%。表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验：分别于第0、2、4、6、8、12、16、24h，精密吸取X1供试品溶液10 µL，注入液相色谱仪，测定其峰面积值A，并统计分析。结果槲皮素和山奈素RSD依次为1.26%、0.81%。表明供试品溶液在24小时内测定稳定性良好。

2.7 重复性试验：精密称取样品X1，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液6份，分别精密吸取10µl，注入液相色谱仪，测定其峰面积值，并计算含量。结果槲皮素和山奈素的平均含量为0.288%、0.153%，RSD分别为1.74%、1.60%。

讨论

1. 本研究中按2015版《中国药典》甘草项下含量测定方法检测了甘草叶中甘草苷和甘

草酸铵，结果甘草苷和甘草酸铵对照品保留时间为28.61 min和31.26min，甘草叶色谱图上无对应峰，故本试验研究中选择了以槲皮素和山奈素为对照品。

2. 课题组研究了蒙药材甘草叶的薄层色谱鉴别。按上述含量测定项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液最终浓缩至1 mL，以槲皮素和山奈素为对照品分别考察了甲苯-甲酸乙酯-甲酸（10:8:1）、环己烷-乙酸乙酯-甲酸（8:4:0.5）和正己烷-乙酸乙酯-甲酸（7:5:0.8）等3种展开系统的展开剂，结果环己烷-乙酸乙酯-甲酸（8:4:0.5）展开系统下所得薄层色谱斑点清晰、分离度高、重现性好。因薄层色谱鉴别研究中的对照品与含量测定研究中对照品一致，故薄层色谱研究未列入正文。

3.本研究采用DAD检测器对检测波长进行考察，结果确定360 nm为最大波长。分别考察了乙腈-水（63:37）、甲醇-水（50:50）、甲醇-水（48:52）、甲醇-0.2%磷酸水（48:52）

和甲醇-0.5%磷酸水（48:52）等流动相，结果流动相为甲醇-0.5%磷酸水（48:52）洗脱时峰纯度高、分离度好、重现性好，故本研究中选择了甲醇-0.5%磷酸水（48:52）为流动相。

4. 本研究考察了流速为0.8、1.0、1.2 mL·min^-1和柱温20、30、40℃时对甘草叶中槲皮

素和山奈素的影响，结果槲皮素和山奈素色谱峰保留时间会随流速提高依次有所前移、随柱温提高渐有前移，但对含量测定结果无影响。

参考文献

[1] 国家药典委员会．中华人民共和国药典·一部[S]．北京：中国医药科技出版社，2015,86.

2. Zheng Y F, Wei J H, Fang S Q, et al. Hepatoprotective triterpene saponins from the roots of Glycyrrhiza inflata[J]. Molecules, 2015, 20(4): 6273-6283.

3. 周成明，弓晓杰.甘草[M].北京：中国农业出版社，2010: 8-11.

基金项目：内蒙古蒙药材标准研究课题（JYCZB18-026）；中央引导地方科技发展专项资金计划项目“蒙医药现代化关键技术研究及蒙药产业化” ；

作者简介：

第一作者：乌云嘎（1993.09-）女，硕士，内蒙古通辽 硕士研究生 初级蒙药师 通辽市中药产业研究中心

通讯作者：郝俊生（1992-），男，硕士，研究方向：蒙药有效物质基础及药理研究。