越橘葡萄籽提取物安全性毒理学研究-中国期刊网

越橘葡萄籽提取物安全性毒理学研究

王东李鹏

洛阳师范学院河南洛阳 471934

【摘要】目的进行越橘葡萄籽提取物安全性毒理学研究。方法采用限量法的雌、雄性小鼠急性经口毒性试验，遗传毒性试验（细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验），90天经口毒性试验。结果在本试验条件下，越橘葡萄籽提取物雌、雄性小鼠急性经口毒性试验的LD₅₀大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；越橘葡萄籽提取物以0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、2.50g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围内；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。结论越橘提取物和葡萄籽提取物配伍长期食用是安全的。

【关键词】越橘提取物；葡萄籽提取物；安全性；长期

萄籽提取物是从葡萄籽中提取的，其重要功效成分为原花青素，它是一种人体内不能合成的新型高效天然抗氧化剂物质，具有超强的延缓衰老和增强免疫力的作用。王亚东^[¹^]等进行了葡萄籽软胶囊毒理学安全性评价，葡萄籽提取物长期食用是安全的。越橘富含原花青素和花青素，是一种具有抗氧化功能的食品。林健^[²^]等进行了欧洲越橘提取物联合使用大鼠30d毒性观察，说明越橘提取物是安全的。本文对越橘葡萄籽提取物进行安全性毒理学试验研究。

1试验材料

1.1试验药物 越橘葡萄籽提取物，是由越橘提取物和葡萄籽提取物混合而成的粉末。越橘提取物经提取（5倍量85%乙醇回流提取3次，每次1小时，提取温度75℃）、浓缩、喷雾干燥等主要工艺加工制成的红棕色粉末，原花青素含量30%。葡萄籽提取物经提取（5倍量70%乙醇提取2次，2小时/次；提取温度为85℃）、过滤、柱层析及洗脱（DM21大孔树脂，提取液上柱，水洗去杂质，用35%~45%乙醇解吸去除杂质，收集乙醇洗脱液，浓缩，再用85%~95%乙醇解吸，收集乙醇洗脱液）、浓缩、喷雾干燥等工艺制成。原花青素含量约96%。越橘葡萄籽提取物人体推荐剂量为0.5g/人/d，其中葡萄籽提取物0.3g,越橘提取物0.2g。

2 试验方法

2.1急性经口毒性试验：采用限量法，选用SPF级健康离乳SD小鼠20只，雌雄各半。急性经口毒性剂量为20.0g/kg.bw。给样后连续观察14天，记录中毒表现及死亡情况。期间每周称量一次体重。

2.2 细菌回复突变试验：采用经鉴定符合要求的鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535五株菌株进行试验。首次试验采用平板掺入法，证实试验采用预培养平板掺入法。采用β-萘黄酮和苯巴比妥钠诱导的大鼠肝S9作为体外代谢活化系统。首次试验剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿，同时设自发回变、溶剂对照和阳性突变对照，通过首次试验确定受试物的溶解度与细菌毒性。根据首次试验结果设定证实试验的剂量设为5000μg/皿、1500μg/皿、500μg/皿、150μg/皿和50μg/皿。样品置于0.103Mpa条件下高温灭菌20min，在无菌条件下，称量受试样品并配制成溶液，受试样品用无菌水配制成50mg/mL，即高剂量组，用无菌水按一定倍比逐级稀释配制成15、5、1.5、0.5mg/mL4个剂量组。

2.3 哺乳动物红细胞微核试验：选用SPF级昆明种小鼠50只，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为5个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的100、200、300倍即0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、2.50g/kg.bw给予，同时设溶剂对照组，40mg/kg·bw环磷酰胺为阳性对照组，采用30h给受试物法两次给受试样品间隔24h，第二次给受试样品后6小时处死动物，取胸骨常规制片、镜检。每鼠计数2000个骨髓嗜多染红细胞（PCE），观察含微核的嗜多染红细胞数并计算微核发生率，以千分率计。每鼠计数200个嗜多染红细胞时所观察到的成熟红细胞数（NCE），并计算嗜多染红细胞与总红细胞比值（PCE/RBC）。

2.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验：选用中国仓鼠肺（CHL）细胞株。据细胞毒性和受试样品溶解情况，选择5000、2500、1250µg/mL3个剂量组进行染色体畸变试验。在无代谢活化条件下，采用直接致突变物丝裂霉素做为阳性对照物，浓度为0.25μg/mL；在有代谢活化条件下，采用间接致突变物环磷酰胺做为阳性对照物，浓度为20μg/mL。试验前一天，将一定数量的细胞接种于培养皿中，放CO

₂培养箱内培养。试验时，吸去培养皿中的培养液，加入一定浓度的受试物、S9mix（不加S9mix时，需用培养液补足）以及一定量不含血清的培养液，放培养箱中处理3h。处理结束后，吸去含受试物的培养液，用PBS溶液洗细胞3次，加入含10%胎牛血清的培养液，放回培养箱,于24h收获细胞。于收获前4h，加入细胞分裂中期阻断剂秋水仙素，作用时间为4h，终浓度为1μg/mL。收获的细胞经消化、低渗、固定后滴片、染色以备阅片。在油镜下阅片，每一个剂量组应分析不少于100个分散良好的中期分裂相。

2.5 90天经口毒性试验：选用体重80±5g SPF级健康离乳SD大鼠80只，雌雄各半，动物购买后适应环境3天进行试验。按体重随机分为4个组，每组10只，雌雄各半。受试样品按人体推荐剂量的100、200、300倍即0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、2.50g/kg.bw给予，同时设溶剂对照组，每日经口灌胃一次，连续90d。每天观察并记录动物的一般表现、行为、中毒表现和死亡情况。每周称1次体重和2次食物摄入量。计算动物增重、摄食量、食物利用率等，在试验前和试验结束时，至少对高剂量组和对照组大鼠进行眼部检查。若发现高剂量组动物有眼部变化，则应对所有动物进行检查。测定血常规、生化等血液学指标。大鼠在试验结束时进行尿液常规检查，实验结束将动物处死并进行大体解剖，肉眼观察有无异常，称量并计算脏体比值，进行主要组织病理学检查。

3 结果

3.1 小鼠急性经口毒性试验：在14d观察期内，雌、雄大鼠外观均正常，四肢活动正常，无死亡。剖检未出现肉眼可见病变。获得雌雄大鼠越橘葡萄籽提取物急性经口毒性试验LD₅₀＞20.0g/kg.bw。根据急性毒性分级标准，将其判定为无毒级物质。

表1 甘油磷脂酰胆碱对小鼠的急性毒性试验结果

动物

品种

性别

初始体重

（g, ）

7天体重

（g, ）

14天体重

（g, ）

途径

MTD(g/kg.bw)

小鼠

雄

20.23±1.58

26.92±1.49

31.24±1.97

经口

>20.0

雌

20.27±0.93

25.47±1.77

28.64±2.28

经口

>20.0

3.2 遗传毒性试验：细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性。

3.3 90天经口毒性试验：以0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、2.50g/kg.bw剂量的越橘葡萄籽提取物经灌胃给予大鼠，连续90天。各组动物生长发育、活动均正常，大鼠毛发光润，摄食、饮水、粪便均正常。无中毒表现和死亡。与阴性对照组相比，各剂量组动物每周体重、体重增加量、进食量和食物利用率均无统计学差异（P>0.05）；各剂量组动物总体重增加量、总进食量和总食物利用率均无统计学差异（P>0.05）。未发现高剂量组和对照组动物有眼部异常变化；各剂量组尿常规指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组的各指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。各剂量组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶、门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、谷氨酰转肽酶、尿素、肌酐、血糖、总蛋白、白蛋白、总胆固醇、甘油三酯、氯、钾、钠的水平等血生化指标与阴性对照组相比，均无统计学差异（P>0.05）。

表1 水飞蓟提取物对大鼠血液生化指标的影响( ±s)（n=10）

性别	检验项目	剂量 (g/kg.bw)
性别	检验项目	对照组	0.083	0.167	0.333
雄	丙氨酸氨基转移酶(U/L）	31±5	29±3	31±5	30±4
	门冬氨酸氨基转移(U/L)	117±11	115±12	111±10	118±9
	总蛋白(g/L)	68.2±2.3	68.5±3.0	67.3±2.6	67.9±3.5
	白蛋白(g/L)	33.2±0.7	33.6±1.6	31.8±0.9	33.5±1.2
	碱性磷酸酶(U/L)	141.3±38.9	139.4±33.5	146.2±41.1	137.3±35.0
	谷氨酰转肽酶(U/L)	0.22±0.24	0.24±0.21	0.28±0.18	0.26±0.14
	血糖(mmol/L)	5.09±0.69	5.20±0.77	4.86±0.83	4.76±0.54
	尿素(mmol/L)	4.67±0.47	4.48±0.69	4.50±0.42	4.43±0.73
	肌酐(μmol/L)	39±4	38±3	35±4	37±3
	总胆固醇(mmol/L)	1.60±0.30	1.47±0.25	1.52±0.27	1.51±0.33
	甘油三酯(mmol/L)	0.95±0.25	0.93±0.16	0.88±0.22	0.86±0.15
	钾离子(mmol/L)	4.92±0.33	4.96±0.41	5.03±0.28	5.14±0.46
	钠离子 (mmol/L)	138.5±1.2	139.2±1.1	137.3±1.4	139.6±1.7
	氯离子(mmol/L)	98.2±1.3	97.8±0.8	97.2±1.4	98.5±0.9
雌	丙氨酸氨基转移酶(U/L）	26±4	23±7	26±6	25±5
	门冬氨酸氨基转移(U/L)	127±14	119±11	123±17	125±16
	总蛋白(g/L)	70.2±1.9	71.4±3.7	72.8±4.2	72.6±2.7
	白蛋白(g/L)	35.1±0.9	34.5±1.5	33.8±1.7	34.3±0.8
	碱性磷酸酶(U/L)	105.3±31.2	111.2±28.8	116.7±33.2	108.9±40.1
	谷氨酰转肽酶(U/L)	0.37±0.32	0.39±0.36	0.34±0.22	0.35±0.26
	血糖(mmol/L)	5.41±0.81	5.30±0.64	5.51±0.72	5.27±0.93
	尿素(mmol/L)	5.70±0.90	5.83±0.77	5.78±0.54	5.52±0.62
	肌酐(μmol/L)	43±5	44±4	43±3	42±4
	总胆固醇(mmol/L)	1.90±0.28	2.04±0.23	1.82±0.32	1.93±0.27
	甘油三酯(mmol/L)	0.72±0.19	0.68±0.26	0.75±0.17	0.82±0.23
	钾离子(mmol/L)	4.65±0.24	4.71±0.30	4.82±0.18	4.96±0.22
	钠离子(mmol/L)	137.1±1.3	135.5±1.2	136.8±1.7	137.7±1.5
	氯离子(mmol/L)	97.6±0.6	96.9±0.9	97.4±1.1	97.1±1.3

各剂量组雌雄大鼠大体解剖观察均未见异常改变。大体解剖观察未发现与受试样品有关的组织病理学改变。

4结论根据GB 15193.1-2014 食品安全国家标准食品安全性毒理学评价程序，本研究针对越橘葡萄籽提取物长期食用安全性进行了研究，采用限量法，在本试验条件下越橘葡萄籽提取物雌、雄性小鼠急性经口毒性试验的LD₅₀大于20.0g/kg.bw，根据急性毒性剂量分级标准，该样品属实际无毒级；细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验、体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果均为阴性；越橘葡萄籽提取物以0.83g/kg.bw、1.67g/kg.bw、2.50g/kg.bw的剂量经口给予大鼠90天，受试动物一般情况良好，体重、食物利用率、脏器重量、脏器系数均无异常改变；眼部检查未发现异常变化；尿液指标、血液学指标及生化指标结果显示，各项指标均在正常范围；各脏器病理组织学检查均未见与受试样品有关的病理改变。越橘提取物和葡萄籽提取物配伍长期食用是安全的。

[参考文献]

[1]王亚东,李立,王海玉,张聪恪,张桂霞,张焱,刘翠娥,葡萄籽软胶囊毒理学安全性评价.河南预防医学杂志,2007,18(6).

[2] 林健,黄宗锈,林蔚,郑丽红,黄佳宁,陈秀锦.叶黄素、欧洲越橘提取物联合使用大鼠30d毒性观察[J].医学动物防制,2017,33(10):1068-1072.

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越橘葡萄籽提取物安全性毒理学研究