正交设计优选泰乐菌素反萃取工艺

正交设计优选泰乐菌素反萃取工艺

管金富 曾淑云 王晓宁 王志明

宁夏泰益欣生物科技有限公司 宁夏回族自治区银川市 750205

摘要：目的 优化泰乐菌素的反萃取工艺。方法 以泰乐菌素收率为指标，考察反萃取温度及pH对泰乐菌素反萃取过程的影响。结果 通过正交设计试验确定泰乐菌素反萃取工艺参数：温度4℃，一次反萃取pH=3.0，二次反萃取pH=2.5，三次反萃取pH=2.0。结论 优化反萃取工艺条件对泰乐菌素收率的提升具有重要意义。

关键词：泰乐菌素，反萃取工艺，正交试验

Orthogonal Design to Optimize Tylosin Back-extraction Process

Ma xiaofang

ABSTRACT: Objective To optimize the tylosin back-extraction process parameters. Methods With the yield of tylosin as an indicators, the effect of back-extraction temperature and pH on the back-extraction process of tylosin was investigated. Results The process parameters of tylosin back-extraction were determined through orthogonal design experiments: temperature 4℃, first back-extraction pH=3.0, second back-extraction pH=2.5, and third back-extraction pH=2.0. Conclusion Optimizing the back extraction process conditions is of great significance to the improvement of tylosin yield.

Keywords: Tylosin, Back -extraction process, Orthogonal experiment

泰乐菌素是上个世纪五六十年代由菌类中得到的抗生素^{[1, 2]}，作为一种大环内酯类，泰乐菌素基本是以各种酸盐的形式存在，比如最常见及使用量最大的是酒石酸及磷酸泰乐菌素，近年来硫酸及盐酸泰乐菌素的使用量也逐渐增加^[3]，这都是源于泰乐菌素具有抗菌谱广及显著的促生长作用，所以才能在养殖业中应用广泛。泰乐菌素的合成提炼包括四个阶段：发酵液的低温下酸处理，常温碱性处理，板框水顶洗过滤、有机溶剂的碱性萃取、各种酸类的反萃取，最终利用碱再回调中和得到泰乐菌素的精制溶液^[4-6]。目前，大生产中泰乐菌素产量的提升成为了最棘手和最关键的问题，在实际的生产中，过滤与萃取环节的收率是基本保持稳定的，而反萃取工艺的收率则偏低，因此，本研究的目的旨在优化反萃取工艺条件，提升泰乐菌素收率。

1、仪器与材料

表1实验仪器与材料

Table 1 Experimental equipment and materials

2 方法

2.1高效液相色谱法测定泰乐菌素含量：

（1）检测条件

选用Xbridge C18色谱柱柱，以2mol/l的高氯酸钠溶液与乙腈作为泰乐菌素高效液相色谱法检测的流动相，其配比为（60：40）

^[7]，以280nm作为检测波长，流速设定为0.5ml/min，进样体积为20ul。

（2）泰乐菌素对照品溶液的制备：

精密称取一定重量的泰乐菌素标准品，加入少许甲醇溶解，再利用去离子水将其定容，配制成0.02、0.06、0.1、0.4、0.8、1.0 mg/ml浓度的标准溶液。

（3）样品的测定：

吸取需要检测的反萃取水溶液，先用去离子水稀释25倍体积，再将稀释后的溶液继续用50%乙腈稀释25倍体积，将配置好的样品溶液于280nm处检测峰面积大小并记录。

2.2泰乐菌素反萃取工艺

将泰乐菌素萃取液（有机层）降至低温，使用0.1mol/L的盐酸溶液进行三次反萃取：第一次pH=3.0±0.1；第二次pH=2.5±0.1；第三次pH=2.0±0.1；收集并合并三次水相即得泰乐菌素反萃取液。

3结果与讨论

3.1标准曲线的绘制

按照常规的方法，利用泰乐菌素标准溶液浓度数据和HPLC检测的峰面积数据建立泰乐菌素标准曲线，最终得到的回归方程为y = 47,509,032.8200 x - 398,256.1020 ，其中r²=0.9990；即在0.01～1.00 mg/mL范围内线性达到满意。

3.2高效液相色谱图

图1泰乐菌素标准品

Fig.1 Tylosin Standard

图2 泰乐菌素反萃取液

Fig.2 Tylosin back-extraction solution

3.2正交试验

由2.2项下的反萃取具体实验步骤及工艺可以看出，在反萃取阶段，只涉及到两个关键控制点，那就是反萃取的温度与酸调节过程中的pH值。针对这两个关键控制点，我们实验室前期已进行了批量的关于反萃取的温度与酸调节pH的单因素实验，确定了温度大约在2℃，pH按照反萃取的次数（一共反萃取三次）依次约在3.0，2.5，2.0左右。因此，本研究在单因素实验的基础上，设计了正交试验，确定了泰乐菌素反萃取工艺的最佳温度及反萃取酸调节pH。

具体的试验因素与水平确定如下：选取反萃取温度及一次反萃取、二次反萃取、三次反萃取pH分别为A、B、C、D 4个因素进行参数化考究，每个因素具有3水平，因素水平表如下所示。

表2正交试验因素水平表

Table 2 Orthogonal factor level table

表3 正交试验结果分析

Table 3 The results of analysis of orthogonal test

由正交试验结果表3可以看出，以泰乐菌素的收率为指标，正交试验中考察的因素的影响强度依次为A>B>C>D，即反萃取温度>一次反萃取pH>二次反萃取pH>三次反萃取pH。设定的三个温度的影响强度是4℃>2℃>3℃，设定的三次反萃取pH的影响强度分别为：3.0>2.8>3.2；2.5>2.7>2.3；2.0>1.8.2.2。由此可推出，A3B2C2D2为最优方案，即温度4℃，一次反萃取pH=3.0，二次反萃取pH=2.5，三次反萃取pH=2.0。

3.3工艺验证

实验室按照选定的反萃取工艺的最优方案条件开展了三组平行实验，三组实验的反萃取收率分别为88.6%，87.9%，87.1%，平均收率为87.9%，RSD为0.85%。三组平行验证实验结果稳定，说明选取的温度及反萃取pH条件是合理可行的。

4结论

本实验优选出的泰乐菌素反萃取的最佳温度及pH条件可以显著的提升泰乐菌素反萃取工艺收率，可适用于大生产中，为泰乐菌素的进一步研究提供理论依据。

参考文献

[1] 曲宁. 酒石酸泰乐菌素颗粒质量研究[D]. 山东大学,2013.

[2] 黄恒，余祖琼，黄文丽. 努比亚山羊泰乐菌素中毒的诊治[J]. 大科技,2017,000(019):219.

[3] 木一. 泰乐菌素畜禽专用抗生素[J]. 中国畜牧杂志,1999(6):57.

[4] 周晋武，吕文进，许永兴. 一种泰乐菌素的提取方法[P].

[5] 王枢，郭竹洁，孟涛. 应用膜分离技术改进泰乐菌素提取工艺[J]. 食品与发酵工业,2011(4):107-111.

[6] 赵体金，尹德芳，董坤. 由发酵液提取泰乐菌素C的初步研究[J]. 中国医药工业杂志,2006(11).

[7] 任玉琴，裘丞军，吴望君. HPLC法同时测定磺胺二甲嘧啶含量和泰乐菌素组分[J]. 中国兽药杂志,2018(7):64-71.