1山东第一医科大学(山东省医学科学院) 生命科学研究中心,山东 泰安 271000
基金项目:国家级大学生创新创业训练计划(201910439007)。
作者简介: 王爱帝,2016级临床医学本科。
#并列第一作者。
*通讯作者:景秀丽,女,副教授,主要从事呼吸道黏膜免疫相关研究。
摘要:研究阿司匹林(Aspirin)可否减轻急性过敏性哮喘症状。以 50μg papain诱导正常C57BL/6小鼠诱导急性过敏性哮喘模型,用阿司匹林腹腔注射小鼠,每天用阿司匹林处理小鼠以达到维持阿司匹林持续效果。处理之后 6 天,pbs、papain、papain +aspirin组进行对比,分别比较各组支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺中炎症性细胞:包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量变化情况。结果:pbs组嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量细胞数量较少;papain组炎症性细胞数量显著增加;而papain +aspirin与阳性对照papain组相比,炎症性细胞数量显著减少。结论:阿司匹林可以减轻炎症,减缓急性过敏性哮喘症状,可能减少哮喘病人对皮质类固醇的依赖。
关键词:急性过敏性哮喘;阿司匹林;嗜酸性粒细胞
哮喘是一种使肥大细胞、树突状细胞等多种炎症细胞激活,淋巴细胞和嗜酸性粒细胞活化并浸润的慢性炎症性疾病 ,以反复发作的气道阻塞和喘息为特征。流行病学调查显示,全世界有3亿多人患有哮喘,且近几年发病率有持续增长的趋势。哮喘由多种危险因素综合引起,其中吸入污染物和环境过敏原,如花粉、动物皮屑和室内尘螨,被认为是哮喘发病的主要原因。现在,多以长效β2受体激动剂和糖皮质激素为主的药物作为一线治疗方案,使大多数轻中度哮喘患者病情得到一定有效控制,然而临床上仍然有接近10%~20%的哮喘患者难以治愈,经过规治疗后病情仍然难以控制。最近有研究表明,阿司匹林可用于缓解慢性支气管哮喘。但是,阿司匹林能否影响急性过敏性哮喘的症状,尚未报道。本研究通过观察支气管肺泡灌洗液( bronchoalveolar lavage fluid,BALF)和肺组织炎症性细胞,包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量变化情况,分析阿司匹林对急性过敏性哮喘小鼠炎症的影响,为探讨阿司匹林治疗哮喘的作用机制打坚定基础,为治疗过敏性哮喘提供的新方法。
1.材料和方法
1.1 材料
正常C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司,aspirin和papain购自Sigma公司。
1.2 动物免疫和处理
将18只C57BL/6小鼠随机分为3组,pbs组、papain组、papain +aspirin组。papain组和papain +aspirin组用50μg过敏原papain连续滴鼻免疫3天(day0、day1、day2),免疫的同时腹腔注射aspirin (200mg/kg/天),诱导正常C57BL/6小鼠急性过敏性哮喘模型。免疫后第6天(day5)处死,分析检测各处理组滴鼻免疫后day5时肺及BALF中炎症性细胞,包括嗜酸性粒细胞、中性粒细胞的数量变化情况。
1.3 方法
1.3.1 BALF中炎症性细胞变化分析
BALF收集及细胞分类计数。免疫后第6天时眼球采血,通过气管插管行支气管肺泡灌洗,分3次缓慢注入PBS液,分别为0.7 mL、0.7 mL和0.6 mL,缓慢收集,回收率约为80%。收集的细胞溶液,2500 r/min 离心, 5min,收集上清液-20 ℃保存待测。沉淀用0.2 mL PBS 重悬,并采用血细胞计数板进行白细胞分类计数。取100 μL 细胞悬液进行离心甩片,晾干后进行Diff-Quik染色,光学显微镜下进行细胞分类计数,数200个细胞,求出各类白细胞百分比,进而计算出各类白细胞的细胞数目。
1.3.2 肺组织中炎症性细胞变化分析
颈椎脱臼处死小鼠,酒精消毒,剪开胸部肋骨取肺脏,放入2 ml含10% FBS的RPMI1640培养基中,培养基再洗1次。弃去RPMI1640培养基,将肺脏剪碎,用IV型胶原酶(1mg/ml)2.5 ml浸泡肺脏,37°C温箱孵育1 h。加MACS液5 ml左右终止消化,反复吹打,在70 μm细胞滤网上研磨肺脏,并反复冲洗滤网,将细胞全部过滤到50 ml离心管中;定容至40 ml,2500 rpm,4°C离心5 min。去上清,加入3 ml 40%Percoll液并与细胞混匀,转移到15 ml离心管中;1400 ×g,23 °C离心20 min。弃上清,加2 ml红细胞裂解液(ACK),混匀,室温裂解2 min后,加MACS液至15 ml终止反应;2500 rpm,4 °C离心5 min。弃上清,加2 ml MACS液,吹打混匀,将单细胞70 μm筛网过滤至15 ml离心管中,过滤完再用MACS冲一下滤网;2500 rpm,4 °C离心5 min。弃上清,细胞沉淀用
0. 4 mL PBS 重悬,并用血细胞计数板进行细胞分类计数。取100 μL 细胞悬液进行离心甩片,室温晾干后进行Diff - Quik染色,光学显微镜下进行细胞分类计数,求数200个细胞,求出各类白细胞百分比,进而计算出各类白细胞的细胞数目。
1.3.3 统计分析
每组 3 只或 3 只以上小鼠,实验独立重复 3 次以上。使用GraphPad Prism6.0 软件。使用独立样本t检验分析数据, *表示 P<0.05,**表示 P<0.01,***表示 P<0.005,****表示 P<0.0001。
2.结果
2.1 阿司匹林对BALF中炎症性细胞的影响。
阿司匹林干预组(papain +aspirin组)小鼠BALF嗜酸性粒细胞、中性粒细胞细胞数目与阳性对照哮喘组(papain组)相比都显著性下降,差异均有统计学意义 (均P<0.01); papain +aspirin组与正常对照组相(pbs组)比, 嗜酸性粒细胞、中性粒细胞细胞数目显著性增加,差异均有统计学意义 (均P<0.05),见图 1。
2.2阿司匹林对肺组织中炎症性细胞的影响。
图2. 各组小鼠肺组织中炎症性细胞分类计数的比较
对肺组织中炎症性细胞进一步观察,发现与BALF中相类似的结果,阿司匹林干预组(papain +aspirin组)小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞、中性粒细胞细胞数目与阳性对照哮喘组(papain组)相比也都显著性下降,差异均有统计学意义 (均P<0.05),但与正常对照组(pbs组)相比,统计无明显差异,见图 2。
3.讨论:
阿司匹林是医药史上三大经典药物之一,是应用最广、最早和最 普遍的解热镇痛药与抗风湿药。它具有抗血小板聚集、解热、抗炎、阵痛多方面的药理作用。有相当一部分研究认为,当摄入阿司匹林和其他非甾体类抗炎药后会出现急性上、下呼吸道反应,即阿司匹林加重性呼吸系统疾病(aspirin-exacerbated respiratory disease,AERD)[2] [3] 。但流行病学调查显示 AERD 在一般人群的患病 率只有约 0.3%~2.5%[4] 。不可忽视的是,阿司匹林在过敏性哮喘的防治中发挥了不可替代的作用。早在 1973 年就有过关于阿司匹林能使部分哮喘病人缓解的报道,1983年 Szezeklik 等人又报道 6 例哮喘病人服用阿司匹林 0.3g~1.2g 后,起到明显的支气管舒张作用, 临床症状和高峰呼气气流速均有改善[5] [6]。张波[7]研究证明阿司匹林对支气管哮喘患儿外周血单核细胞分泌 IL-2 有上调作用,对 IL-4 的分泌有下调作用; 吴树君[8] 研究得出适量的阿司匹林对气管平滑肌的扩张具有较好的作用功效,上述两个研究[7] [8] 皆是进一步说明阿司匹林可用于治疗慢性支气管哮喘。但是,阿司匹林能否影响急性过敏性哮喘的症状,尚未报道。我们的研究表明阿司匹林能通过减少BALF和肺组织中炎症性细胞,即嗜酸性粒细胞和中性粒细胞细胞数量,减轻过敏性哮喘炎症症状。哮喘的一线用药糖皮质激素并不能抑制哮喘中所有炎症反应,且其副作用与依赖性不容小觑。寻找安全、有效的替代药物已是必然趋势。因此,本研究可能减少了哮喘病人对皮质类固醇的依赖,为研制新的哮喘防治手段提供新思路。
参考文献
Boonpiyathad T,Sözener ZC,Satitsuksanoa P,Akdis CA: Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol, 2019, 46:101333.
José Carlos RodríguezJiménez, Morenopaz FJ , Luis Manuel Terán, et al. Aspirin exacerbated respiratory disease: Current topics and trends[J]. Respir Med,2018,135:62-75.
张财云,陈蔚. 对阿司匹林加重性呼吸系统疾病的研究进展[J].当代医药论丛,2018,16(22):19-21.
J.-H. Choi, J.-H. Kim, H.-S. ParkUpper. Airways in aspirin-exacerbated respiratory diseaseCurr. Opin. Allergy Clin. Immunol,2015,15:21-26.
Szezeklik A. Asthma improved by aspirin-likr drugs. Br J Dis Chest,1983,77:153.
纪树国,王志. 一个矛盾的临床现象——阿司匹林类药既能诱发哮喘又能缓解哮喘[J]. 实用内科杂志,1987, 05:258-259.
张波. 阿司匹林对哮喘患儿IL-2和IL-4的调节作用[J]. 江苏医药,2010,36(17):2019-2020.
吴树君. 阿司匹林对在体及离体气管平滑肌的影响[J]. 海峡药学,2017,29(09):115-116.