阿哌沙班清洁验证分析方法开发与验证

阿哌沙班清洁验证分析方法开发与验证

郭春兰，刘莹

南京正大天晴制药有限公司 江苏 南京 210000

摘要：在阿哌沙班合成生产过程中，为避免上一步工序的残留物对下一步工序的反应产生干扰，需对相应工序结束后清洁状况进行验证，以确保风险目标物得到有效清除。本方法对阿哌沙班中间体Ⅱ（268-7）、阿哌沙班清洁验证分析方法进行色谱条件开发优化，最大程度地避免了清洁擦拭棒的影响。

关键词：清洁验证；方法开发；阿哌沙班

阿哌沙班用于预防接受择期髋关节或膝关节置换术的成年患者出现静脉血栓栓塞症(vte)事件。本实验所涉及的清洁验证目标物是经过缩合、取代等一系列反应制得阿哌沙班的过程中的中间体Ⅱ（268-7）以及阿哌沙班。其中中间体Ⅱ（268-7）为缩合取代工序的清洁目标物，阿哌沙班为氨化及精制工序的清洁目标物。实验室使用高效液相色谱仪（HPLC）外标法定量分析目标药物残留量。

1. 原因分析

中间体Ⅱ（268-7）、阿哌沙班为目标物，需开发清洁方法。可考虑尝试用相同的流动相进行等度洗脱，并缩短运行时间。同一套色谱条件中定量分析两种目标物的残留量，同时可避免擦拭棉签中的杂质对目标物的干扰，提高了实际操作过程中的便利，也大大减少了检验所需的时间。

2. 材料与方法

   1. 材料

      1. 主要实验仪器及设备

高效液相色谱仪（Agilent1260安捷伦），超声波清洗器（CPX8800H-C型），电子天平（梅特勒，XPE205DR，精度：十万分之一），抽滤瓶，循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司，SHZ-DⅢ）。

1. 1. 2. 主要实验药品及试剂

中间体Ⅱ（268-7）对照品、阿哌沙班（262-5）对照品、乙腈、乙酸铵

1. 2. 方法

      1. 对照品定位溶液制备

分别称取阿哌沙班中间体Ⅱ（268-7）对照品、阿哌沙班（262-5）对照品各5mg置50 ml量瓶中，加35%乙腈溶解并定容至刻度，摇匀，再分别移取上述溶液各1ml，混匀。

1. 1. 2. 实验参数选择

使用安捷伦高效液相色谱仪，流速为1.0 ml/min、进样量为20 μl、柱温为30 ℃、检测波长为280 nm。

使用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂 [Inertsil ODS-3，(150 mm×4.6 mm，5 μm) ]色谱柱；尝试使用0.01mol/ml乙酸铵:乙腈（70:30）、（80:20）、（65:35），不同有机相比例的流动相等度洗脱色谱柱，以考察不同色谱柱及不同比例有机相的流动相对目标物出峰情况及空白擦拭棉签干扰情况的影响。实验列表见表一：

表一：试验参数选择的条件及结果对比

3. 结果与分析

   1. 专属性实验

空白溶剂、空白擦拭棒液相色谱图中，268-7和阿哌沙班位置均未出现干扰峰，且前后出峰达到基线分离；证明该方法的专属性良好。

1. 2. 进样精密度实验

目标物的6份等体积的对照品溶液测定结果峰面积RSD分别为：268-7： 0.1%；阿哌沙班：0.1%；证明该方法的仪器进样精密度良好。

1. 3. 溶液稳定性实验

目标对照品溶液在常温条件下贮存24小时的峰面积相对误差均小于2.0%，证明该溶液在24小时内稳定。

1. 4. 定量限实验

用建立的分析方法测试268-7的定量限为0.05254μg/ml，连续6针峰面积RSD为5.1%，保留时间RSD为0.5%；阿哌沙班的定量限为0.0244μg/ml，连续6针峰面积RSD为3.9%，保留时间RSD为0.1%；证明其精密度良好。

1. 5. 检出限实验

用建立的分析方法测试268-7的检测限为0.02627μg/ml， 阿哌沙班的检测限为0.01220μg/ml。

1. 6. 线性实验

在0.05254 μg/ml～104.7946 μg/ml范围内，268-7峰面积与浓度相关系数为1.0000；在0.0244μg/ml～9.4755μg/ml范围内，阿哌沙班峰面积与浓度相关系数为0.9999；证明该范围内线性良好。

4. 结论

本次方法对比了不同有机相比例[0.01mol/l乙酸铵:乙腈（80:20）、（70:30）、（65:35）]对目标物出峰情况以及空白擦拭棉签干扰情况的影响，结果显示使用Inertsil ODS-3，(150 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，0.01 mol/l乙酸铵:乙腈（65:35）为流动相时，空白擦拭棒色谱图中对目标物无干扰，目标物峰形较好，基线平稳，重现性良好，且运行时间最短，并且良好地通过了方法学学研究。故最终采用该系统作为色谱柱及流动相组成。

参考文献

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