注射用头孢曲松钠无菌检查法验证研究

注射用头孢曲松钠无菌检查法验证研究

刘凤姣

深圳立健药业有限公司 广东 深圳 518000

摘要：目的 临床对患者注射头孢曲松钠进行治疗前，需对药物展开无菌检查，对患者的健康和安全进行保证，本文在此基础上分析此药物无菌检查的验证方法。方法 研究按照无菌检查法的相关操作规范，展开无菌检查时使用薄膜过滤法对注射用头孢曲松钠展开相关无菌检查，同时在此基础上对方法进行验证。结果 临床中对可溶性药物展开无菌检查时，薄膜过滤法是其中十分重要的方法，但是针对于具有不同性质的药物来说，其具体的操作过程需进行相应的调整。结论 在薄膜过滤法中应用分次冲洗和分次过滤是注射用头孢曲松钠无菌检查的一种重要方式，同时也是首选方法。

关键词：无菌检查法；薄膜过滤法；注射用头孢曲松钠

对于无菌检查法来说，此方式主要是检查无菌和药品和原料以及医疗器具还有各种敷料等是否无菌的一种方法。在整个药品的安全性检查方面是其中十分重要的一个项目。中国药典早在多年前就已经开始强调检验方法展开必要的方法验证，对无菌检查时药品的应用方式进行验证，通过对其方法展开验证，对供试品的检验方式和检验人条件进行确定，以此对无菌检查方法检验结果的准确性和检查方法的科学性进行保证。对于注射用头孢曲松钠来说，其属于第三代的头孢菌素，耐酶是其最为重要的特点，可以对多种β内酰胺酶的降解作用进行抗制，所以此药物对第一代和第二代的头孢菌素耐药的某些菌株依然十分有效。

1. 资料和方法

   1. 一般资料和仪器

此次研究所需应用的仪器主要有：全自动数显生化培养箱、灭菌刻度吸管、全自动数显恒温鼓风干燥箱和试管以及培养皿还有全封闭集菌培养器还有全自动数显立式蒸汽灭菌器等。研究中的供试品为注射用头孢曲松钠。此次研究的培养基及试剂主要为：0.1%蛋白胨水溶液和营养肉汤培养基(以及胰酪大豆胨液体培养基还有硫乙醇酸盐流体培养基，所有稀释液和培养基全部按照中国药典的灭菌法进行相关操作，并在121℃的环境下展开为期15min的灭菌操作。对于验证的试验用菌种来说主要为：枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、生孢梭菌和金黄色葡萄球菌以及大肠埃希菌还有黑曲霉菌等，这些使用需要使用的菌种全部为第四代菌种。

1. 2. 方法和结果

1.2.1 菌液制备

接种铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，这些菌种全部在30℃~35℃的环境下培养18h~24h。接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中，20〜25°C培养24〜48h，上述培养物用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位）的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20〜25℃培养5〜7天，加入3〜5ml含0.05% (ml/ml)聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (ml/ml)聚山梨醋80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成每lml含孢子数小于l00cfu的孢子悬液。备用。具体的活菌计数如下表一所示。

表一 研究中活菌计数情况

1.2.2 培养基灵敏度的检查

按照中国药典中的相关规范要求，胰酪大豆胨液体培养基和硫乙醇酸盐流体培养基的空白对照在3d和5d的分别培养后没有长菌，枯草杆菌、生孢梭菌和铜绿假单胞菌以及金黄色葡萄球菌在加菌的培养基管中都在一天就出现了明显的浑浊情况，黑曲霉菌和白色念珠菌在培养的2天产生的了十分明显的浑浊情况，各个管中的阳性菌其生长情况十分良好。

1.2.3 验证方法

①选择15瓶样品，每一瓶中以5ml的菌0.9％氯化钠溶液溶解，然后将其转移到300ml 0.1%的蛋白胨水溶液中进行冲洗滤膜3次。每张滤膜每次100ml的冲洗液，展开最后一次的冲洗工作时在其中分别加入不大于100cgu的大肠埃希菌和生孢梭菌以及金黄色葡萄球菌。然后在此基础上加入硫乙醇酸盐流体培养基100ml，此为1号管。然后再选择另一个试管，试管中装有同体积培养基，并在其中加入等量的实验菌，将其作为2号管进行对照。采用同样的方式通过相应的培养基作白色念珠菌和枯草芽孢杆菌以及黑曲霉菌的试验。同样将其作为阳性进行对照，对其结果进行观察。

② 选择15瓶样品，每一瓶中以5ml无菌0.9%氯化钠溶液溶解，然后在此基础上将其转移到600ml的0.1%蛋白胨水溶液冲洗滤膜，对其冲洗6次，每次使用100nl冲洗液冲洗，剩余步骤和①相同。

③ 选择15瓶样品，每一瓶中以5ml无菌0.9%氯化钠溶液溶解，将5瓶转移到300ml 0.1%蛋白胨水溶液中，然后分别使用分次冲洗和分次过滤的方式，过滤时每次过滤5瓶供试品的300ml 0.1%的蛋白胨水溶液，然后在此基础上使用0.1%蛋白胨水溶液对滤膜进行冲洗，一共对其冲洗三次，每次冲洗液为50ml，同时还需进行反复震动摇晃，其余步骤方法和①相同。

1.2.4 结果

通过三种方式的操作，其中阴性对照管都没有长菌，2号管中的大肠埃希菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌以及生孢梭菌都在培养24小时后产生了十分明显的浑浊情况，同时呈现出阳性，黑曲霉菌和白色念珠菌经过48小时的培养后逐渐出现浑浊，并呈现出阳性，所以此试验结果成立。

2. 讨论

对于第一种方法来说，其属于常规的薄膜过滤法，抗生素在供试液中的浓度一般比较高，所以在进行冲洗时十分困难，可以将细菌的抗菌活性充分表现出来，此情况下让阳性的对照组菌细菌的生长被严重抑制。第二种方法增加了冲洗次数和稀释液的用量，但是因为增加的次数以及用量不够，而且在进行冲洗时也没有进行震动摇晃，所以实际的冲洗效果并不是十分理想。抗生素在供试液中的滤膜上以及培养器内壁留下了很大的吸附量，所残留下来的抗生素均具有这很好的抗菌活性，细菌的生长得到有效抑制。第三种方法应用了分次冲洗和分次过滤的方法，抗生素在供试液中的浓度被极大的降低。在整个冲洗过程中通过不断的震动摇晃，让冲洗的效率得到了极大的提高，以此对阳性对照菌生长受到样品的影响有效消除。如果冲洗液的总量达到了1350ml，每张膜仅仅只能通过500ml以内的冲洗液，对可能污染微生物的生长并不会造成严重影响。

参考文献：

1. 肖莉. 注射用头孢曲松钠无菌检查法验证[J]. 中国药师, 2011(11):146-148.

2. 聂渝琼, 高锦, 张梅,等. 注射用头孢曲松钠无菌检查方法研究[J]. 中国医药, 2012, 07(11):1456-1457.

3. 郑笠.注射用头孢曲松钠无菌检查方法验证试验[J].福建医药杂志,2009,31(06):102-103.