沉默 P75NTR基因对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

沉默 P75NTR基因对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响

谭伟

贵州医科大学附属医院骨科 贵州 贵阳 550001

摘要：目的 本课题通过下调p75NTR表达，然后观察其对神经细胞凋亡的影响以及脊髓损伤修复的效果。方法 实验采用8周龄雄性Wistar大鼠72只，以改良Allen 打击法制作脊髓胸9-11(T9-11)损伤模型，造模成功后，实验动物随机均分为四组：（A)对照组；（B) 脊髓损伤组；（C) P75NTR-RNAi注射组,；（D）空载慢病毒组。各组分别造模后1d、7d、21d三个时间点（1）HE染色观察脊髓损伤病理情况变化；（2）免疫组化染色检测脊髓组织P75NTR表达；（3）TUNEL检测脊髓组织神经细胞凋亡；（4）进行 BBB 评分。结果（1）HE染色：造模后1d时P75NTR -RNAi 组、脊髓损伤组和空载慢病毒组受损脊髓组织内出血、坏死及渗出，炎性细胞以单核细胞和淋巴细胞为主。造模后7d、21d时P75NTR -RNAi 组较脊髓损伤组和空载慢病毒组的脊髓坏死减轻，炎性细胞数量减少，存活神经元数目较多。（2）免疫组化：造模后1d、7d时， P75NTR -RNAi 组P75NTR表达量低于脊髓损伤组和空载慢病毒组，差异有统计学意义（P<0.05）。（3）TUNEL检测：P75NTR-RNAi组神经细胞的凋亡明显少于空载慢病毒组、脊髓损伤组，且差异具有统计学意义（p <0.05)。（4）BBB 评分： 造模后1d各组间大鼠BBB评分差异无统计学意义（p ＞0.05)，造模后7d、21d P75NTR-RNAi组BBB评分高于空载慢病毒组、脊髓损伤组，且差异具有统计学意义（p <0.05)。结论 通过下调脊髓损伤后P75NTR表达，可减少继发性神经细胞凋亡，并在恢复期改善脊髓神经功能。

关键词：脊髓损伤、P75NTR、神经细胞、凋亡

资金资助：贵州省科技合作计划项目（黔科合LH字[2015]7393号），贵州省卫生计生委科学技术基金项目（gzwjkj2016-1-030）

脊髓损伤（Spinal Cord Injury，SCI)是一种严重的创伤疾病，具有高死亡率和高致残率的特点。^[1-2] 在脊髓损伤中，由于脊髓神经元不可再生，故脊髓损伤后，神经细胞凋亡的数量必将影响疾病的最终预后^[3]。P75NTR与脊髓损伤间病理关系密切，是凋亡过程中重要的递质^[4、9] 。然而，脊髓损伤后P75NTR表达的变化特点及其对神经细胞凋亡的影响和作用机制还不明确，尚需深入研究。为此，我们应用RNA干扰( ＲNA interference，ＲNAi) 技术，构建P75NTR基因RNA干扰 (RNA interference，RNAi)慢病毒载体。，研究P75NTR表达变化对大鼠脊髓损伤后神经细胞凋亡的影响，为脊髓损伤的作用机制研究及治疗提供新思路。

1 材料与方法：

1.1材料：

SPF级Wistar大鼠由重庆腾鑫生物技术有限公司提供，LB培养基、胎牛血清购自GIBCO公司；pLVX-p75NTR-RNAi慢病毒和慢病毒空白载体，由慢病毒pLVX-shRNA2载体质粒，P75NTR基因的siRNA序列及慢病毒包装系统（pLVX-p75NTR-RNAi，PG-p1-VSVG，PG-P2-REV,PG-P3-RRE4个质粒混合物）构建所得，该载体可针对P75NTR基因发挥RNA干扰效应；胰蛋白酶、青霉素-链霉素抗生素购自中国碧云天公司；T4 DNA 连接酶购自NEB公司；BamHI 、EcoRI 、Marker DL2000 、PrimeSTARTM HS DNA聚合酶购自TaKaRa公司； 质粒小量提取试剂盒购自Qiagene 公司; 小量DNA 胶回收试剂盒购自Qiagen公司。

1.2 SCI模型建立及实验分组：

雄性6-8周龄、220~250g，SPF级Wistar大鼠，72只，随机分为4组，每组16只：① 假手术对照组；② 脊髓损伤组；③ 空载慢病毒组；④ P75NTR -RNAi 组；假手术对照组只进行椎板咬除，但不进行脊髓撞击。余三组采用改良Allen 打击法于T9-11节段建立SCI模型，将10 g重物从5cm高度垂直打击该节段背侧正中。空载慢病毒组于造模成功后在损伤部位注射空载转染的慢病毒（注射量106~107TU/5l）。P75NTR -RNAi 组于造模成功后在损伤部位注射P75NTR -RNAi转染的慢病毒（注射量106~107TU/5l）。

1.3 取材和切片制备

在SCI后1d、7d、21d，麻醉大鼠后行4%多聚甲醛心内灌注固定，自背部打开椎管暴露脊髓，取损伤段脊髓约5mm，用4%多聚甲醛固定过夜，然后脱水、石蜡包埋、行横切面5 mm厚度连续切片备用行HE染色，凋亡细胞检测及免疫组织化学检测。

1.4苏木精-伊红染色(HE染色)观察各组大鼠脊髓组织形态 ：

步骤简述如下：先将切片烤片、脱水脱蜡，PBS冲洗，DAB显色，苏木素染色，梯度酒精脱水、中性树胶封片。显微镜下观察。

1.5免疫组化

按试剂盒说明检测P75NTR，以Image-pro plus 6.0软件分析平均光密度值（Mean Density, MD）,以5个视野平均光密度的平均值作为该张切片的测量值，分别表示各组p75NTR表达量。

1.6 Tunel法检测凋亡细胞

Tunel法标记凋亡细胞，按原位凋亡试剂盒操作规程进行，染色后光镜下观察。Tunel计算高倍视野下细胞凋亡指数（apoptotic index , AI ）, 即每张片选取6个阳性细胞最多的高倍视野，计算平均阳性细胞百分数。

1.7大鼠神经行为学功能评分

参照Basso等^[5]提出的大鼠SCI后后肢功能评判标准（BBB法），由3名经过培训的人员分别独立评分后去均值进行统计学分析。

1.8统计学分析：

采用SPSS 17.0 统计软件包进行分析，正态分布定量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用单因素方差分析及LSD 法两两比较，满足方差齐性要求采用LSD法。

2 结果：

2.1 HE染色:

与假手术组相比，造模后1d时P75NTR -RNAi 组、脊髓损伤组和空载慢病毒组受损脊髓组织内出血、坏死及渗出，炎性细胞以单核细胞和淋巴细胞为主。造模后7d、21d时P75NTR -RNAi 组较脊髓损伤组和空载慢病毒组的脊髓坏死减轻，炎性细胞数量减少，存活神经元数目较多。见图1-2。

图1：SCI后7d各组大鼠脊髓组织病理学变化(HE x100）

注：a:假手术组；b:脊髓损伤组；c:空载慢病毒组；d:P75RNA-RNAi组。

图2：SCI后21d各组大鼠脊髓组织病理学变化(HE x100）

注：a:假手术组；b:脊髓损伤组；c:空载慢病毒组；d:P75RNA-RNAi组。

2.2 免疫组化:

造模后1d、7d时， P75NTR -RNAi 组P75NTR表达量低于脊髓损伤组和空载慢病毒组，差异有统计学意义（P<0.05）。造模后21d时，脊髓损伤组和空载慢病毒组P75NTR表达减少，与P75NTR -RNAi 组比较无统计学差异（P＞0.05）。见图3。

图3：SCI后21d各组大鼠脊髓组织中P75NTR免疫组化表达

注：a:假手术组；b:脊髓损伤组；c:空载慢病毒组；d:P75RNA-RNAi组。

2.3 TUNEL法:

TUNEL标记法阳性染色细胞核固缩，呈棕褐色，可见于神经元和少突胶质细胞。各组SCI大鼠于造模后1d即有凋亡细胞表达，P75NTR -RNAi 组各时间点大鼠细胞AI低于模型对照组和空载慢病毒组，且差异均有统计学意义（P<0.05）；

2.4 BBB评分：

各组大鼠造模后1d仅有轻微的后肢运动，但各组间BBB评分比较差异无统计学意义(P＞0.05)。术后7d P75NTR -RNAi 组BBB评分高于模型对照组和空载慢病毒组，且差异均有统计学意义（P<0.05）；空载慢病毒组BBB评分与模型对照组比较无明显差异（P＞0.05）。术后21d，P75NTR -RNAi 组BBB评分高于模型对照组和空载慢病毒组，且差异均有统计学意义（P<0.05）；空载慢病毒组BBB评分与模型对照组比较无明显差异（P＞0.05）。见表1。

表1 各组大鼠运动功能BBB评分评定结果

表注：与脊髓损伤组及空载慢病毒组比较，^aP＜0.05。

3 讨论：

SCI发生后，损伤部位的神经组织除直接外伤造成原发损伤外，还因迟发性神经细胞坏死、崩解和凋亡形成继发性损伤，其程度有时比原发性损伤更重。［6］因此降低继发性损伤的损害，减少细胞凋亡的发生，是促进脊髓功能的恢复的关键。低亲和力神经生长因子受体P75NTR是一种主要的神经营养因子受体，参与发育和成年中枢神经系统(CNS)的多种功能。尽管人们已经知道它几十年了，但它的全部功能还远未完全阐明。依赖于与其他受体的复杂相互作用以及细胞环境，P75NTR能够执行相互矛盾的任务，如介导细胞死亡以及细胞存活。

^[7、8]siRNA是一种短片断双链ＲNA 分子，能够在细胞内与其含有互补序列的mＲNA 识别并结合，并在特异性酶的作用下使其相应的基因沉默，这种现象被称为RNAi^［9-10］。RNAi技术具有普遍、操作简单的特点，并能特异而有效地阻断靶基因的表达。目前，SCI急性期神经细胞的凋亡机制并未完全清楚，且缺乏对凋亡干预的有效手段，严重制约了SCI治疗的进展。因此，通过RNAi技术沉默大鼠SCI后P75NTR表达，探索P75NTR表达变化对SCI急性期神经细胞凋亡及神经功能修复的影响，对开发新型SCI治疗策略具有重要的临床意义。本研究结果显示：P75NTR -RNAi 组在损伤后7d、21d时HE染色较模型对照组和空载慢病毒组：脊髓坏死减轻，炎性细胞数量减少，存活神经元数目较多。P75NTR -RNAi 组大鼠在损伤后1d、7d时P75NTR表达水平及凋亡细胞计数均低于模型对照组和空载慢病毒组且差异有统计学意义，BBB评分在1d时高于模型对照组和空载慢病毒组但无统计学意义，在7d时高于模型对照组和空载慢病毒组且差异有统计学意义，在21d时明显高于模型对照组和空载慢病毒组且差异有统计学意义。

综上所述，通过RNAi干扰技术下调大鼠SCI后P75NTR表达水平，可减少继发性神经细胞凋亡，并在恢复期改善脊髓神经功能，为SCI的治疗提供了新的方向。

参考文献：

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