一种新的CD123嵌合抗原受体T细胞的构建及其抗白血病作用探究

(整期优先)网络出版时间:2020-08-10
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摘要目的构建一种新的靶向CD123的嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞),为CD123阳性白血病的免疫治疗提供实验参考。方法通过单克隆筛选技术获得能稳定分泌CD123抗体的杂交瘤细胞株6E11,将杂交瘤细胞扩增后腹腔注射至Balb/c小鼠腹腔内,收集腹水并处理、纯化得到单克隆抗体,测定抗体效价并对其特异性进行验证;RT-PCR法获得轻链和重链可变区序列,并以此为基础利用分子克隆技术构建一种新的靶向CD123嵌合抗原受体,包装病毒后感染T细胞制备CD123 CAR-T细胞,通过功能实验初步探讨6E11 CAR-T细胞体外抗白血病的能力。结果①获得1株稳定分泌抗人CD123抗体的杂交瘤细胞株6E11并获得其可变区序列。②6E11单克隆抗体对CD123蛋白亲和性高,解离常数(Kd值)为2.10 nmol/L,特异性识别CD123阳性细胞且与CD123阴性细胞无交叉反应。③成功构建了CD123 CAR慢病毒载体,感染T细胞后获得了靶向CD123的CAR-T细胞(6E11 CAR-T),感染效率大于60%。④6E11 CAR-T能明显杀伤CD123阳性靶细胞MV4-11,效靶比1∶1时6E11 CAR-T细胞对MV4-11细胞的杀伤比例明显高于Vecor-T细胞[(98.60±1.20)%对(20.28±6.74)%,P<0.001],但对CD123阴性靶细胞K562没有明显杀伤作用。⑤MV4-11细胞可以显著激活6E11 CAR-T,但对Vecor-T细胞无明显激活作用[(26.33±3.30)%对(1.17±0.06)%,P<0.001]。⑥6E11 CAR-T与MV4-11细胞共培养上清中细胞因子水平均显著高于Vecor-T组[IL-2:(92.90±1.51)pg/ml对(6.05±3.41)pg/ml,P<0.001;TNF-α:(1 407.20±91.95)pg/ml对(7.86±0.85)pg/ml,P<0.001;IFN-γ:(5 614.60±170.17)pg/ml对(8.42±2.70)pg/ml,P<0.001],但与K562细胞共培养后,两组各细胞因子水平差异无统计学意义。⑦6E11 CAR-T在与CD123阳性急性髓系白血病(AML)原代细胞共培养过程中被显著激活,且能有效杀伤原代AML细胞。结论杂交瘤细胞株6E11能稳定分泌高效特异的抗人CD123单克隆抗体,可用于检测表达人CD123的细胞,也能应用在靶向人CD123蛋白的肿瘤免疫治疗中,以6E11 Ig可变区序列为抗原识别区的CD123 CAR-T细胞,具有明确的体外抗白血病活性,为进一步的临床研究奠定了基础。