ABCC10在浸润性乳腺癌中的表达及耐药研究

ABCC10在浸润性乳腺癌中的表达及耐药研究

陈飞，路选，王颖

扬州市第一人民医院江苏扬州225001

摘要：目的:检测ABCC10在浸润性乳腺癌组织中的表达,探讨其与组织学类型、分级和TNM分期的关系,检测ABCC10阳性与阴性癌组织对化疗药物的敏感性。方法:采用免疫组化EnVinsion法检测ABCC10在55例浸润性乳腺癌组织中的表达,进行统计学分析。采用MTT法检测相应癌组织对化疗药物的敏感性,分析其与ABCC10表达的相关性。结果:ABCC10主要定位于胞膜上和胞质中。阳性率为67.3%,不同病理分级、TNM分期间ABCC10表达差异均有统计学意义(P=0.002、0.001)。乳腺癌组织的耐药性试验结果与其相应组织中ABCC10的表达做相关性检验,紫衫醇、多西他赛、表阿霉素(P=0.000),相关系数分别为分别为0.561、0.614、0．512。结论:ABCC10在乳腺癌组织中高表达,表达的高低与组织学分级,TNM分期成正相关,显著影响紫杉醇等化疗药物的耐药产生。

关键词：乳腺癌，化疗，耐药

【中图分类号】R712.5【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0135-02

化疗是乳腺癌综合治疗的重要组成部分，但化疗的疗效与肿瘤细胞是否耐药有密切的关系，一旦出现耐药现象，包括原发性和继发性耐药，则会导致化疗疗效差，对于乳腺癌化疗耐药的研究，目前热点在于肿瘤耐药基因及其相关蛋白的研究[1]。研究表明ABC家族膜转运体在耐药中起主要作用[2]，ABC膜转运蛋白家族即ATP结合盒(ATPbindingcassette,ABC)膜转运蛋白家族，其耐药作用是通过膜转运蛋白把细胞癌细胞内的化疗药物泵出细胞外来实现，ABC家族的一个亚家族（C族）也称为MRP（multidrugresistanceprotein，多药耐药相关蛋白）家族，人类ABCC10（MRP7）是MRP家族最新发现的成员[3]。但ABCC10与乳腺癌的关系研究甚少，本文就乳腺癌中ABCC10的表达以及对常见乳癌化疗药物的耐药实验，来对乳腺癌耐药的机制做一个探讨。

1材料与方法

1.1标本来源

收集2014年11月-2015年11月我院乳腺外科浸润性乳腺癌组织手术切除标本及相应正常组织55例。患者平均年龄(56.13±8.70)岁,中位年龄61岁。其中髓样癌3例，粘液癌1例，浸润性导管癌51例,手术前患者均未行化疗或放疗。术后即刻将标本置于预先盛有无菌RPMI1640培养液的无菌管中,部分新鲜癌组织用于化疗药物药敏试验,将相应标本用10%甲醛固定,经脱水、透明,常规石蜡包埋。由病理科经验丰富医师进行癌组织病理分类、分级诊断,术后进行TNM分期。

1.2主要试剂

ABCC10兔抗人多克隆抗体购自美国SantaCruzTechnology公司,二抗购自美国SantaCruzTechnology公司,免疫组化试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。紫杉醇、多西他赛购自扬子江药业、表阿霉素、环磷酰胺、吉西他滨、长春瑞滨分别购自辉瑞制药有限公司、德国BAXTERONCOLO公司、江苏豪森药业、吉林一心药业公司。RPMI1640、胎牛血清购自美国Gibco公司,胰蛋白酶和购自Amroso公司,MTT和DMSO为Sigma公司产品。

1.3方法

1.3.1癌组织药物敏感实验将新鲜癌组织用含青链霉素的生理盐水反复冲洗,匀浆破碎癌组织，用尼龙膜过滤后,用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度到105mL-1,台盼蓝染色计数;将细胞悬液接种于96孔培养板,190μL/孔,设空白组、对照组和实验组(实验组分为高浓度和低浓度组),每组设4个复孔;在37℃、5%CO2培养箱培养24h,加入上述化疗药10μL,使高浓度组的终浓度为人体血浆浓度。阴性对照孔和空白孔加10μLRPMI1640，培养48h后每孔加入5mg/mL的MTT20μL，继续培养4h。吸去上清后，每孔加入二甲基亚砜150μL，混匀，振荡培养板10min，使孔中沉淀完全溶解。酶标仪读取波长570nm处各孔吸光度值。

1.3.2ABCC10蛋白检测标本经5Lm连续切片,分别做HE和免疫组化染色。免疫组化染色采用两步法(EnVisionTM),步骤如下:切片脱蜡至水,尿素消化,3%过氧化氢封闭,用柠檬酸缓冲液进行微波修复,冷却,兔血清封闭,加一抗(1B200)4e过夜。从冰箱取出37e复温,用自来水冲洗抗体,加入山羊二抗(EnVision),37e恒温反应(中间各步用PBS洗),加DAB显色,显微镜观察终止显色。用苏木精轻微复染,脱水透明封片,在光镜下观察。对照组设正常组织和空白(以PBS代替一抗)对照。

1.4判定标准

1.4.1药物敏感性判定IR<30%为耐药,31%~50%低度敏感,51%~70%为中度敏感,>70%高敏[4]。计算药物抑制率(IR)。

IR(%)=对照组OD值-药物组OD值×100%

对照组OD值-空白组OD值

1.4.2免疫组化结果判定ABCC10以细胞膜及胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞,每例均随机观察5个高倍视野(@400),判断结果按照二级计分法,阳性

细胞数目[5%为0分,5%~25%为1分,26%~50%为2分,51%~75%为3分,>75%为4分。染色强度分类:淡黄色为1分,黄色及深黄色为2分,褐色及深

褐色为3分。将细胞阳性率与染色强度两者积分相乘:0分为阴性(-),1~4分为弱阳性(+),5~8分为中度阳性(++),9~12分为强阳性(+++)。

1.5统计学方法

采用非参数检验的方法对癌组织的组织学类型TNM分期以及病理分级进行单因素分析。癌组织耐药性试验结果与其相应组织ABCC10表达进行Spearman秩相关检验,以rs表示秩相关系数。使用SPSS17.0软件进行统计学处理。检验水准A=0105。

2结果

2.1免疫组化结果和ABCC10的表达与临床病理因素的关系免疫组化结果显示,ABCC10阳性表达主要定位于胞膜上和胞质中(图1)。阳性表达率为67.3%,不同病理分级、TNM分期之间ABCC10的表达差异均有统计学意义,P<0.05;并且病理分级、TNM分期越高ABCC10表达的阳性率越高(表1)。

3讨论

目前乳腺癌的治疗，是坚持标准化与个性化的综合治疗，其中，化疗是乳腺癌全身治疗的重要组成部分，可不管化疗药物如何进步，化疗方案如何优化，有效性的上升总是很缓慢，而且开始有效的药物，可能会在一段时间后变得不再有效，这与肿瘤细胞产生耐药有重要关系。当前很多研究证明多药耐药（MDR）成为化疗失败的重要原因。MDR，即肿瘤细胞一旦对一种抗癌药物产生耐药，就可对非同一类型的多种结构、细胞靶点和作用机理迥然不同。耐药相关标志与治疗药物或化疗方案密切相关且非常复杂［4－5］。近一段时间，ABCC家族成为肿瘤多药耐药的研究热点之一，其中研究表明ABCC10的水平影响肿瘤的生长、迁移的同时也是介导多种肿瘤化疗敏感性的功能蛋白[6-8]，它介导的药物外排在MDR中起了重要作用[9]。有研究发现[10-11]，ABCC10在非小细胞肺癌、头颈部癌的多药耐药产生中有重要作用。但ABCC10在乳腺癌中的研究甚少。

本实验运用免疫组化法证明了ABCC10在乳腺癌组织中有过表达现象,ABCC10在阳性表达率为67.3%,不同病理分级、TNM分期之间ABCC10的表达差异均有统计学意义,P<0.05;并且病理分级、TNM分期越高ABCC10表达的阳性率越高(表1)。提示ABCC10可能与乳腺癌的发生、发展过程具有某种联系。并且说明ABCC10的表达与乳腺癌较高的恶性生物学行为有关。

针对ABCC10与乳癌化疗耐药的关系研究，本实验对乳腺癌组织与几种常见化疗药物进行了耐药性试验,分析不同化疗药物的耐药现象与相应组织中ABCC10表达的相关性。结果显示,紫杉醇等几种药物对不同ABCC10强度表达下的耐药对比，p值均小于0.05.其中多西他赛、紫杉醇、表阿霉素的P值均=0.000,rs分别为0.561、0.614、0．512。总的来说,乳腺癌组织对几种化疗药物的耐药性与不同的ABCC10表达强度成正相关,其中相关最显著的是紫杉醇、多西他赛和表阿霉素，这也是目前乳腺癌化疗单药最有效药物与最具代表性的药物，rs值均大于0.5，这说明ABCC10的表达对这三种化疗药耐药的影响最大，相关性相对较小的是环磷酰胺、长春瑞滨与吉西他滨，rs小于0.5，提示ABCC10的表达水平对这后三种药物的耐药性不是太显著。

上述实验所揭示的ABCC10与乳癌化疗耐药有关的现象，对于知道我们临床化疗有一定意义，而且对于解决化疗耐药提供了一定的思路，未来在针对通过药物调整乳腺癌ABCC10的表达从而纠正化疗耐药的研究可能成为一个方向。

=参考文献>

[1]赵宇斌，张少华，王金清，等．乳腺癌组织ＥｐｈＡ２和ＥｐｈｒｉｎＡ１蛋

白表达及临床意义的探讨［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２０１１，１８（７）：５１３－５１６．

[2]KruhGD,BelinskyMG.TheMRPfamilyofdrugeffluxpumps.Oncogene,

2003,22(47):7537-7552..

[3]KaoHH,ChangMS,ChengJF,etal.Genomicstructure,geneexpression,andpromoteranalysisofhumanmultidrugresistance-associatedprotein7[J].JBiomedSci,2003,10(1):98-110.

[4]JianHJ，JinQC，LongYJ，etal．Breastcancerresistanceproteinexpressionand5-Fluorouracilresistance[J]．BioEnvirSci,2008,21(2):290-295．.

[5]RodriguesFF,SantosRE,MeloMB,eral．CorrelationofpolymorphismoftheMDR-1geneandtheresponseofprimarychemotherapyinwomenwithlocallyadvancedbreastcancer

[J]．GenetMolRes,2008，7(1):177-183.

[6]DomanitskayaN,Wangari-TalbotJ,JacobsJ,PeifferE,MahdaviyehY,PauloseC,

MalofeevaE,FosterK,CaiKQ,ZhouYetal:Abcc10statusaffectsmammarytumourgrowth,

metastasis,anddocetaxeltreatmentresponse[J].Britishjournalofcancer2014,111(4):696-707.

[7]KathawalaRJ,WeiL,AnreddyN,ChenK,PatelA,AlqahtaniS,ZhangYK,WangYJ,

SodaniK,KaddoumiAetal:ThesmallmoleculetyrosinekinaseinhibitorNVP-BHG712

antagonizesABCC10-mediatedpaclitaxelresistance:apreclinicalandpharmacokineticstudy[J].

Oncotarget2015,6(1):510-521.

[8]WijnholdsJ:Drugresistancecausedbymultidrugresistance-associatedproteins[J].Novartis

Foundationsymposium2002,243:69-79;discussion80-62,180-185.

[9]HuangY,SadeeW.Membranetransportersandchannelsinchemoresist-anceandsensitivityoftumorcells[J].CancerLett,2006,239(2):168-182。

[10]王鹏，张志培，王小平，等．非小细胞肺癌组织ABCC10的表达及其与耐药相关性的研究［Ｊ］．中华肿瘤防治杂志，２０１0，１7（8）：605－608．

[11]NaramotoH,UematsuT,UchihashiT,etal.Multidrugresistanceassociatedprotein7expressionisinvolvedincross-resistancetodocetaxelinsalivaryglandadenocarcinomacelllines[J].IntJOncol,2007,30(2):393-401.