探讨儿童遗传性耳聋基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA基因直接测序异常结果分析

探讨儿童遗传性耳聋基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA基因直接测序异常结果分析

勾晶严铁明彭菲

黑龙江省佳木斯市妇幼保健院154002

摘要：目的研究并探讨儿童遗传性耳聋基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA基因直接测序异常结果。方法分析48例GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA直接测序法的异常结果。结果GJB2基因发现4个突变位点，包括：79G>A、341A>G、109G>A和235delC，12sRNA发现三个突变位点，即：1382A>C、1438A>G、1555A>G，SLC26A4和GJB3基因均未见突变；突变频率最高的突变位点是GJB279G>A和12sRNA1438A>G，其次是GJB2341A>G。结论GJB2和12sRNA基因可能是黑龙江省最常见的致聋基因，两个基因的热点突变与国内其它地方报道的有差异。

关键词：遗传性耳聋；测序；GJB2；SLC26A4；GJB3；12srRNA

ObjectivetostudyandexploretheabnormalresultsofgeneticdirectdeafnessgeneGJB2，SLC26A4，GJB3and12srRNAgenesinchildren'shereditarydeafnessgenes.Methodstheabnormalresultsof48casesofdirectsequencingofGJB2，SLC26A4，GJB3and12srRNAwereanalyzed.ResultstheGJB2genefound4mutations，including：79G>A，341A>G，109G>Aand235delC，12sRNAfoundthreemutations，namely：1382A>C，1438A>G，1555A>G，SLC26A4andGJB3geneshavenomutation；mutationmutationisthehighestfrequencyofGJB279G>Aand12sRNA1438A>G，followedbyGJB2341A>G.ConclusionGJB2and12sRNAgenesmaybethemostcommondeafnessgenesinHeilongjiangprovince.ThehotspotmutationofthetwogenesisdifferentfromthatinotherplacesinChina.

[Keywords]hereditarydeafness；sequencing；GJB2；SLC26A4；GJB3；12srRNA

耳聋是人类最常见的感觉神经系统缺陷。我国2008-2010年先天性障碍发病率分别为1.99‰、2.15‰和2.19‰，呈上升趋势。超过50%的儿童耳聋为遗传基因缺陷所致，在遗传性耳聋中70%以上为非综合征耳聋[1]。研究表明中国人的大部分非综合征性耳聋由几个主要基因的突变引起[2]，如GJB2、SLC26A4、12srRNA，新一代高通量测序技术的出现，提供了以数据为导向的新的遗传性疾病研究模式。然而耳聋基因突变有一定的地域和种群差异，我们利用直接测序法筛选中国人常见的4个耳聋候选基因GJB2、SLC26A4，GJB3、12srRNA对48例儿童非综合性耳聋做了分析。

一、资料与方法

1.1.病例资料

此次研究的对象是选择48例听力障碍儿童，来自佳木斯市妇幼保健院耳鼻喉门诊，且在黑龙江省听力诊断中心诊断为听力障碍患儿。年龄1-14岁，平均年龄5.3岁，男28例，女20例。所有病例通过病史调查（包括家族史、耳聋史及耳毒性药物的使用情况等）和听力学检测证实为非综合性耳聋。听力损失程度根据纯听力图，分别计算双耳气导0.5KHz、1KHz、2KHz、4KHz处的平均听阈，按WHO标准进行分类：听力正常：≤25dBHL；轻度听力损失：26～40dBHL；中度听力损失：41～70dBHL；重度听力损失：71～90dBHL；极重度听力损失：>90dBHL。所有患者家长均签署知情同意。

1.2.研究方法

1.2.1.试剂与仪器

血液基因组DNA提取试剂盒及测序试剂均来自深圳华大基因医学有限公司，定性PCR仪为BIO-RADC1000型；凝胶扫描仪为UVPEC3ImagingSystem；电泳仪为Bio-Rad产品；遗传分析仪AB3500型。

1.2.2.利用primer5.0和oligo7.0设计引物，引物经上海生工合，Page纯化。

1.2.3.标本采集与基因组DNA提取

采集静脉全血5ml，EDTA-K2抗凝，所有血样用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，保存于-20℃备用。

1.2.4.PCR扩增

PCR反应体系为：PCRBuffer2.5μL，MgCl22.0μL，10mmol/LdNTP0.75μL，10pmol/μL引物各0.8μL，TaqDNA聚合酶0.5μL，模板2μL，加水至25μL；PCR扩增条件：94℃2min；94℃20s，57℃20s，72℃30s，35个循环；72℃5min；4℃保存。

1.2.5.DNA测序

PCR产物4μL在1.5%琼脂糖凝胶上电泳，紫外观察为清晰明亮的目的扩增条带（无杂带），扩增片段用上、下游引物正反向分别测序。

二、研究结果

2.1测序结果突变类型

GJB2基因发现4个突变位点，包括：79G>A、341A>G、109G>A；12sRNA发现三个突变位点，即：1382A>C、1438A>G、1555A>G。SLC26A4和GJB3基因均未发现突变。

2.2.突变基因型、临床表型及突变频率

48例测序发现最常见的突变12sRNA1438A>G，和GJB2基因79G>A，其突变频率都达25.68%，其次是GJB2341A>G，突变频率为18.92%，发现1例GJB279G>A、341A>G和12sRNA1438A>G复合突变。

三、讨论

随着人类基因组计划的实施和完成，耳聋致病基因的发现和克隆也取得了很大的进展，遗传性耳聋的致病基因及同一基因的突变位点在不同种族，甚至同一种族不同地区的人群中不尽相同，有很强的种族特异性。全国性耳聋分子流行病学调查显示我国感音神经性聋患者由几个主要基因主几热点突变引起，包括：GJB2基因（35delG、176del16、235delC、299delAT）、SLC26A4基因（2168A>G、IVS7-2A>G）、GJB3基因（538C>T）以及12sRNA（1494C>T、1555A>G）等。我们设计合成的5对引物其PCR扩增片段包含了以上4个基因的热点突变位点。GJB2基因是最常见的致聋基因，高达21.01%的耳聋患者携带该基因突变；其次是大前庭水管综合征的责任基因SLC26A4，其在耳聋人群中的检出率占15%以上；另外，对氨基糖苷类抗生素异常敏感而至聋的12sRNA1555A>G和1494C>T检出率分别3.43%和1.03%。本文48例耳聋基因测序结果异常但临床表型正常的有4例，为先证者的兄弟（或姐妹），实际临床患有耳聋为42例，GJB2基因检出率为69.05%（29/42）；12sRNA检测出率为52.38%（12/22）。这和全国的调查结果有差异。

本文检出的GJB279G>A和341A>G导致编码的第27位和114位分别从缬氨酸突变为异亮氨酸和谷氨酸转变为甘氨酸，尽管有6例GJB279G>A和341A>G临床表现为正常，但它和其它耳聋基因突变组成复合突变时临床表现中度或轻度听力损失，表明携带GJB279G>A和341A>G突变对遗传性非综合征性耳聋的发生具有密切的相关性，对于非综合征性耳聋发病有较高风险，这与文献报道一致。

本文发现的GJB2109G>A，12sRNA1382A>C国内文献报道不明。GJB2109G>A为突变杂合子，导致第37位缬氨酸突变为异亮氨酸，临床上表现中度听力损失，提示该位点突变为该病例的关键因素，其致病机制需要更进一步研究。12sRNA1382A>C检出2例突变，其中1例与12sRNA1555A>G组合成复合突变，临床上表现重度耳聋，2例均有氨基糖苷类抗生素用药史，提示该位点亦是导致药物性耳聋的作用靶点。

参考文献：

[1]李亮，鲁建光，刘颖，等.先天性非综合征型耳聋相关基因检测及热点突变分析[J].中华耳科学杂志，2012，10（2）：246-251.

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[3]余咏梅，焦扬，顾娟，等.云南省白族、彝族遗传性非综合症性耳聋人群GJB2基因突变研究[J].昆明医学院学报，2010，31（6）：16-20.

[4]刘杨，董明敏.河南地区非综合症型耳聋患者GJB2基因突变分析[C].中华医学会第十次全国耳鼻咽喉-头颈外科学术会议论文汇编.1058.

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[6]惠培林，郭玉芬，鲍晓林，等.中国西北地区耳聋家系中GJB2基因突变频率分析[J].中华耳科学杂志，2008，6（4）：385-388.

[7]陈俞.新疆维吾尔族和汉族非综合症性耳聋基因常见突变的研究（学位论文）[D].乌鲁木齐；新疆医科大学，2011：1-115.