电针刺预处理对大鼠脾细胞凋亡细胞膜途径的影响

电针刺预处理对大鼠脾细胞凋亡细胞膜途径的影响

李红霞1翁亦齐2喻文立（通讯作者）

天津市第一中心医院300000

摘要：目的探讨针刺对大鼠脾缺血再灌注的保护机制。方法32只大鼠随机分4组（每组8只），分别为假手术组（Ⅰ组）、缺血再灌注组（Ⅱ组）、针刺预处理+缺血再灌注组（Ⅲ组）、缺血再灌注6h后针刺组（Ⅳ组）。制取脾标本，观察其组织形态学变化；免疫组化检测caspase-3和caspase-8蛋白。结果caspase-3蛋白的表达在Ⅲ组和Ⅳ组明显少于Ⅱ组，有统计学意义（P<0.01），其中Ⅲ组的表达又少于Ⅳ组，有统计学意义（P<0.01）。caspase-8蛋白的表达在Ⅱ组，Ⅲ组和Ⅳ组间比较无统计学意义（P>0.05）。结论针刺可以抑制大鼠脾细胞缺血再灌注损伤，其机制可能与抑制caspase-3蛋白表达有关，且缺血再灌注前进行针刺预处理这种保护作用更明显。

关键词：针刺；缺血/再灌注；脾；caspase-3；caspase-8

Effectofelectricacupunctureduringdifferentperiodsoncellmembranepathinratswithsplenicapoptosis

【Abstract】Objective：Tostudytheeffectofelectroacupuncture（EA）againstapoptosisofspleenischemiareperfusioninjuryinrabbits.

Methods：Tirty-twomaleWistarratswererandomlypidedintofourgroups：shamoperation（groupⅠ），ischemia-reperfusion（groupⅡ），electricacupunctureprecondi-tioningcombinedwithischemia-reperfusion（groupⅢ）andelectricacupuncture6hafterischemia-reperfusion.spleentissuewasobtained.Caspase-3andcaspase-8proteinwasdeterminedbyimmunohistochenistryinthem.Results：Thelevelofcaspase-3proteinweresignificantlylowerinthegroupⅢandgroupⅣthanthoseingroupⅡ（P<0.01）.Buttherewasnosignificantdiferenceofexpresionincaspase-8（P>0.05）amongthethreegroupsmentioned.Conclusion：Electricacupuncturereducessplenocellularapoptosisinratswithspleenischemia-reperfusioninjury，andthemechanismmayberelatedtothereductionofCaspase-3expression，especiallywhenpreconditioning.

【Keywords】acupuncture；schemia-reperfusion；spleen；caspase-3；caspase-8

在针刺对细胞凋亡的影响的研究中，已证实针刺可以通过对凋亡相关基因的调控实现对凋亡的影响[1]。但目前大部分研究对象为心脑肺等脏器，对胃肠道的研究相对较少。本试验选择缺血再灌注的脾细胞为研究对象，着重探讨针刺对凋亡细胞膜途径的影响机制，以及不同时间针刺对细胞凋亡的影响有无差别。

材料与方法

主要试剂兔抗大鼠Caspase-3和Caspase-8（购自北京中杉公司生物技术有限公司），兔抗大鼠二抗（美国LI-COR公司）。

试验动物及分组健康雄性Wistar大鼠32只，体重300-500g之间，由哈尔滨医科大学第二附属医院动物试验中心提供。试验前适应性饲养1周，术前12h禁食，自由饮水。32只大鼠随机分为4组（n=8只）：假手术组（Ⅰ组）、缺血再灌注组（Ⅱ组）、针刺预处理+缺血再灌注组（Ⅲ组）、缺血再灌注6h后针刺组（Ⅳ组）。

穴位选择及操作针刺穴位选择双侧“三阴交”穴，定位取穴按华兴邦等人研制的大鼠穴位图谱。针刺预处理+缺血再灌注组（Ⅲ组）每日一次通电留针30min，连续波，频率2Hz，强度以针柄颤动，但能使动物不挣扎嘶叫，保持安静为度，连续7日。缺血再灌注6h后针刺组（Ⅳ组）于缺血再灌注6h后开始针刺，操作同Ⅲ组，每日一次，连续7日。

模型制备将EAP+IR组大鼠四肢捆绑，固定在固定架上。用10%水合氯醛腹腔注射（0.3mL/100g）麻醉，麻醉后仰卧固定于手术台。手术处理：（1）假手术组（Ⅰ组）：开腹后不实施缺血再灌注处理，温盐水纱布覆盖于切口，60min后缝合腹肌及皮层组织，6h后取部分脾组织置于4%多聚甲醛中；（2）缺血再灌注组（Ⅱ组）和针刺预处理+缺血再灌注组（Ⅲ组）：从大鼠尾静脉推注1ml的肝素（50U/mL）盐水。开腹后，寻找腹腔干，分离脾动脉，用无损伤血管夹夹闭脾动脉主干，缺血60min后去夹闭，缝合腹肌及皮层组织后再灌注6h，然后迅速取部分脾组织置于4%多聚甲醛中；（3）缺血再灌注6h后针刺组（Ⅳ组）：手术同Ⅱ组和Ⅲ组，于7日后取部分脾组织置于4%多聚甲醛中。

测定方法及指标采用链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶免疫组化法检测Caspase-3和Caspase-8蛋白表达情况。Caspase-3，Caspase-8蛋白主要表达在胞浆核周围，经显色剂二氨基连苯胺（DAB）显色呈棕黄色。显微镜下观察，每张切片随机取10个视野，计数阳性细胞数（棕黄色细胞为阳性），取平均值。

统计学处理用SPSS13.0软件进行分析，计量数据用（±s）表示，进行完全随机设计方差分析，并进行组间两两比较。P<0.01为差异有统计学意义。

结果

注：四组间两两比较：★P<0.01；Ⅱ组，Ⅲ组和Ⅳ组两两比较：▲P>0.05；Ⅰ组和Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组两两比较：●P<0.01。

caspase-3蛋白的表达在针刺预处理+缺血再灌注组（Ⅲ组）和缺血再灌注6h后针刺组（Ⅳ组）明显少于缺血再灌注组（Ⅱ组），差别有统计学意义（P<0.01），其中Ⅲ组的表达又少于Ⅳ组，差别有统计学意义（P<0.01）。caspase-8蛋白的表达在Ⅱ组，Ⅲ组和Ⅳ组间比较无统计学意义（P>0.05），见下表。

讨论

缺血再灌注损伤是一个常见的病理生理过程，其产生因素和发生机制尚未清楚。一般认为，缺血再灌注能够诱发细胞凋亡或者说细胞凋亡参与了缺血再灌注损伤发生、发展过程[2]，这可能与自由基攻击、细胞内钙超载及后者所诱发的细胞因子释放等多种因素有关[3]。有研究发现小肠缺血再灌注后脾脏免疫细胞的凋亡基因表达明显改变，在调亡的细胞膜通路中，caspase-8为启动酶，caspase-3为效应酶，caspase-3再激活内源性核酸内切酶，导致染色质DNA在核小体连接部位断裂，形成以180～200bp为最小单位的单体或寡聚体片段，完成细胞凋亡过程[4]。

电针作为传统针灸与现代电刺激技术结合的产物，在脑缺血性疾病的治疗中得到了广泛的应用[5]。针刺最大的优点在于副作用小。有研究表明电针刺可以通过调节多种调亡相关基因的表达，阻止脑缺血后脂质过氧化连锁反应、抑制兴奋毒性作用和调节钙稳态、防止神经细胞内钙超载等方式产生抗调亡的作用[6]。朱燕珍等研究表明，针刺百会、大椎和双侧肾俞穴可以通过降低大鼠海马CA1区P53的表达从而降低caspase-3蛋白的表达治疗血管性痴呆[7]。目前，关于针刺抗凋亡作用的研究主要集中在心脑肺等脏器，近年来，也出现对胃肠道和肝肾等脏器的研究，但对脾的研究尚未见报道。基于此，本试验选择大鼠脾细胞为研究对象，从凋亡的细胞膜途径探讨针刺对脾细胞凋亡的影响。刘丹等人在研究针刺对bcl-2/bax的影响中发现缺血再灌注后6h，即凋亡早期进行针刺对凋亡的抑制作用优于缺血再灌注后12h及24h[8]，故本试验选择缺血再灌注后6h这个时间点与缺血损伤前针刺预处理进行比较。

三阴交是足太阴脾经上肝脾肾三经交会穴。具有健脾利湿的作用。治疗脾胃疾病等多用三阴交。按照寻经取穴和左右配穴法的原则，本试验选用三阴交来证实针刺对脾细胞缺血再灌注的影响。

研究结果显示：caspase-3蛋白的表达在针刺预处理+缺血再灌注组（Ⅲ组）和缺血再灌注6h后针刺组（Ⅳ组）明显低于缺血再灌注组（Ⅱ组），差别有统计学意义（P<0.01）；在针刺预处理+缺血再灌注组（Ⅲ组）明显低于缺血再灌注6h后针刺组（Ⅳ组），差别有统计学意义（P<0.01）。说明针刺可以通过降低caspase-3蛋白的表达来抑制脾细胞凋亡，并且，在缺血损伤前进行针刺预处理的效果明显优于缺血再灌注后再进行针刺治疗。Caspase-8蛋白的表达在假手术组（Ⅰ组）和其余三组之间比较有统计学意义（P<0.01），但其余三组间两两比较无统计学意义（P>0.05），不能证明针刺可通过抑制caspase-8蛋白的表达来抑制脾细胞凋亡。

综上所述，在大鼠脾细胞凋亡的细胞膜途径中，针刺可以通过下调caspase-3蛋白的表达产生抗凋亡作用。在凋亡的细胞膜途径中，Fas与FasL结合，激活caspase-8，caspase-8再激活caspase-3，完成细胞凋亡过程。针刺对这一过程的影响应该既有直接作用又有间接作用，即在直接抑制上述三种蛋白的表达同时，再通过上游蛋白的抑制作用使下游蛋白的表达也相应减少。本试验对caspase-8蛋白表达情况的检测结果未表现出针刺的间接作用。可能的原因为：在凋亡过程中既有促凋亡基因产生的正反馈作用，也有抗凋亡基因产生的负反馈作用，两者在细胞不同的状态下达到不同水平的平衡，使凋亡朝着不同的方向发展[9]。本试验中针刺的间接作用可能就是被这种并存的负反馈机制掩盖。第三，可能存在一些尚不可知的机制。上述观点有待进一步研究证实，但这一结果支持了针刺对caspase-3具有直接作用。本试验的研究结果进一步证明了针刺可以通过调节凋亡相关蛋白的表达产生抗凋亡作用，并且这种作用在进行针刺预处理的情况下表现得最明显。与目前已有的研究成果对照，可以粗略得出这样的结论：针刺的抗凋亡机制不存在组织选择性。但尚需对更多组织细胞及凋亡蛋白上游基因的研究来支持这一结论。

参考文献：

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[2]SunK，LiuZS，SunQ.Roleofmitochondriaincellapoptosisduringhepaticischemia-reperfusioninjuryandprotectiveeffectofischemicpostconditioning[J].WorldJGastroenterol，2004，10（13）：1934-1938.PMID：15222040

[3]KakinokiK，FujinoY，SuzukiY，etal.Protectionagainstischemia/reperfusioninjurybythecavitarytwo-layermethodincaninesmallintestinaltransplantationwithreductionofreactiveoxygenspecies[J].Surgery，2004，135（6）：642-648.PMID：15179370

[4]AlfredAyala，DoreenE.Wesche-Soldato，MarioPerl，etal.BlockadeofApoptosisasaRationalTherapeuticStrategyfortheTreatmentofSepsis，NovartisFoundSymp.2007，280：37–164.

[5]朱永磊，宋小鸽，等.针刺对细胞凋亡的影响，中医药临床杂志[J]，2007，19（2）：102104.

[6]ZhongGX，ResearchontheimpactofacupunctureonNF-kBtransductionsysteminChronicAtrophicGastritisrats，2014，GuangzhouUniversityofChineseMedicine.

[7]朱燕珍等.电针治疗血管性痴呆大鼠对海马CA1区p53表达的影响，福建中医药[J]，2007，38（2）：4546.

[8]刘丹，韩威，张迪，等.不同时间针刺对局灶性脑缺血再灌注大鼠BCL-2Bax蛋白表达的影响，中华中医药学刊[J]，2007，25（3）：622623.

[9]WuZL，LiCR，LiuZL，Effectsofacupunctureat“Zusanli”（ST36）oneosinophilapoptosisandrelatedgeneexpressioninratswithasthma.ChineseAcupuncture＆Moxibustio，2012（08）：721-725.