常规HE染色背景及各种污染的常见情况及解决方法

常规HE染色背景及各种污染的常见情况及解决方法

潘秀兰

浙江绍兴新昌县中医院病理科312500

摘要：目的：病理石蜡切片及HE染色，也就我们所说的病理常规制片，这个工作是病理诊断中的一个非常重要的环节，制片的质量好坏直接影响病理诊断结果，从而影响该患者的后期诊疗。方法：对于医院来讲，病理诊断的准确与否又与该医疗机构的总体医疗质量和医疗水平息息相关。因此病理病理切片质量的坏坏是临床病理质量控制的关键环节和基础，高质量的病理切片能提高病理诊断水平，减少病理诊断中的差错的发生1。病理切片的制作过程较为繁琐，在实际工作中常常会遇到各种各样的原因引起的质量不佳，甚至造成不良后果，每一个细小的环节出现问题，都会给后面的工作造成影响2。结果：例如：固定不及时导致的组织细胞溶解，取材不仔细造成的细小病灶的遗漏，脱水不彻底造成的组织蜡块发软，染液不净造成的各种背景污染等等。结论：很多环节出现的问题在后续工作中都是很难再得到纠正和补救的，尤其第一步组织固定不佳导致的各种问题，因此在实际工作中我们认真细致地对待每个环节，显得尤为重要。这里将主要针对HE常规切片的背景及各种污染处理展开相关讨论，对各种潜在的影响加以分析和注意，在工作中不断总结经验教训，控制制片质量。

关键词：石蜡切片；HE染色；背景处理；影响因素

1.资料与方法

1.1相关流程及各个环节的背景污染控制

1.2.固定

充分、及时地固定手术标本是常规病理制片的关键和基础。固定指的是固定液和组织内的蛋白质发生交联，使得标本组织内的蛋白质变性、组织硬化、结构固定①，固定也是苏木素和伊红燃料可以更好地着色组织切片的前提。组织固定的意义在于能够使组织尽量保持在活体内原来的形态，是细胞内各种化学成分得以定位不可溶性，沉淀、凝固细胞内物质。组织标本离开活体后，应该马上浸入固定液中，原则上要求在30-60分钟内组织应该得到有效的固定，包括需要充足的固定液（一般要求固定液是组织标本5~10倍体积以上）。一旦组织标本固定不佳在后续的工作中都是无法得到有效补救的。

组织标本固定，我们大多选用甲醛（HCHO）固定，甲醛是目前最为理想的组织固定液之一，它不但价格实惠，同时兼顾防腐作用的它可以很好地保存标本，尽管它会破坏血红蛋白无法保持组织切片原来的颜色。甲醛饱和液偏酸性，影响组织细胞核的染色，尤其是放置久后，容易析出细小的黑褐色或黄黑色的颗粒，也就是甲醛色素颗粒，它很容易沉积在组织切片中，尤其比较容易出现在血液和血浆分布较丰富的区域，以及自然腐败较重的组织，有时甚至可以作为组织出血指示剂，从而影响诊断医生的常规读片和诊断。

甲醛色素颗粒背景，我们可以在组织石蜡切片脱蜡后用浓氨水1ml+75%乙醇溶液200ml溶液浸泡30分钟来处理切片，显微镜下观察脱色素情况，然后用流水冲洗5分钟以上，再进行常规染色，色素背景颗粒可以得到有效消除。10%中性缓冲福尔马林为我们常规制片的首选固定液，也就是将甲醛稀释10倍后加适当的磷酸盐缓液等，配制成PH大约为7.2左右的10%甲醛（实际上为4%的浓度），因为它可以有效地减少和消除甲醛色素颗粒，而且也是目前免疫组化染色标本较理想的固定液3。注意：在甲醛固定液中加入一些普通的白粉笔，使得溶液呈中性或者偏弱碱性，也可以起到一定的作用。

1.2组织取材

组织标本经过充分固定后，一般看片医生会进行相应地取材，也就是在寻找组织标本中病变或者可疑部位进行取材。取材的合格与否也是直接影响下一步脱水透明的，所以标本取材也要大小适中，组织面原则上最大面上限为3.5cm*1.8cm，除对包膜等有特色要求者例外，通常我们取材为2.5cm*1.5cm，厚度不超过2~3mm。规范化地切取组织标本也是切片质量的重要保证。每一例组织取材完后，都应该将剩余的组织标本放回相应的标本袋中，并封口，然后用流水冲洗取材台面和相关器材，以免造成标本之间地交叉污染。尤其是像大多数综合性医院宫内物等破碎的血液标本相对比较多，很容易粘在镊子和取材台的缝隙间，稍有不慎就很容易被取材医生包入下一例组织标本中：不同组织类型间的污染，我们镜下可以很快辨认出污染背景，然后剔除污染的背景或者将蜡块溶解后重新包埋，以得到一个正确干净的HE切片背景；如果是同一类型的组织标本污染，就很难辨认哪些是污染背景，哪些是需要检查的组织标本，造成诊断的困难，甚至出现结果差错。因此取材台面和器材的冲洗应相当规范仔细，取材医生认真负责显得相当重要。

1.3标本脱水

病理科组织标本脱水现在基本都是全自动或半自动脱水机进行，人工脱水基本已经被淘汰，脱水试剂的质量就由我们人为控制。每个设立病理科室的医疗机构都必须制定严格的脱水更换制度，有时甚至可以根据脱水标本的量化进行更换，脱水的梯度酒精二甲苯石蜡试剂应根据每个医疗机构的标本进行设定，一旦到了更换时间，一定要及时更换，时刻关注日常组织蜡块切片是否顺利来判断脱水试剂情况，且不可因为一时偷懒而随意进行组织脱水处理。试剂时间久置后，酒精的浓度都会相应地降低，而且试剂缸里也会出现相应的一些絮状沉淀，有时还会造成不可预见的不明污染背景。部分不能及时更换试剂的单位，至少应对相应的试剂进行过滤处理，使得组织标本可以得到一个相对干净的处理条件。像宫内物这种比较破碎的标本，应像胃镜小标本一样用滤纸进行包裹才可放入包埋盒中，且不可因为偷懒直接将这种破碎的组织标本直接放入包埋盒中而造成不必要的交叉污染。

1.4常规HE染色（脱蜡、染色、脱水、透明）

烤片后的脱蜡我们也应该相当重视起来，对脱蜡的二甲苯和无水酒精应该严格按照相关更换制度定期更换。二甲苯一旦浓度达不到要求，切片蜡就容易脱不干净，切片就会出现蜡影，染色后会出现嗜碱性片状模糊，毛玻璃样现象，染色不均，有时还会出现小红色的碎片背景。酒精梯度应该严格控制，以免水分过快进入细胞而破坏了细胞结构，最终影响了染色效果。

1.5封片（盖玻片）

盖玻片和载玻片一样，有杂质覆盖在镜下造成污染，所以一旦发现盖玻片不净，不适合封片时，应该果断丢弃不用，有时甚至是整盒，如果发现几盒都用不净现象，应该及时告知科负责人和采购人员，联系厂家更换盖玻片或者要求脱货，重新联系新的供销商。

2讨论

制作出一张病理常规切片，每个病理技术员都轻而易举，要制作出好的组织切片，那就需要我们去认真钻研考究，解决操作过程中出现的各种问题。组织切片的制作步骤复杂，影响因素也颇为繁多，而且很多因素和效果都是关联性重叠的，因此我们必须认真对待每一步，严格按照相关要求和制度操作，在工作中不断发现问题1，解决问题，制作出自己满意并让大家都认可的优良切片。

参考文献：

[1]谢小英，石伶俐.常规石蜡切片质量的控制.华北煤炭医学院学报，2008﹐9：10-5

[2]陈俊艳.常规病理切片制作中常见的问题及处理方法.实用医技杂志，2012﹐7：19-7

[3]吕俊耀，于晓军，刘卯阳，等.常规组织切片染色制作中常见问题及解决方法.汕头：法医学杂志出版社，2008﹐2：2-1