细叶卷柏孢子萌发研究

细叶卷柏孢子萌发研究

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【摘要】本文旨在研究细叶卷柏孢子萌发条件。选用不同的基本培养基、添加剂活性炭及激素组合培养细叶卷柏的成熟孢子，观察孢子的萌发情况。结果显示细叶卷柏的孢子在培养基组成为1/2MS﹢BA(2.0mg/L)﹢NAA(1.0mg/L)的条件下萌发状况最好，在1/2MS﹢BA(1.0mg/L)﹢NAA(0.5mg/L)也有较好的长势，而其他组成的培养基中孢子生长缓慢。本研究发现孢子的萌发与MS、BA、NAA浓度比有关，BA和NAA2:1比例萌发率高。

关键词：细叶卷柏；孢子萌发；组织培养

细叶卷柏SlaginellalabordeiHieron是卷柏属当中的一种，是我国民间使用的珍稀药用植物，全草入药，微苦、涩、凉，入肺、肝、脾、大肠四经，具有清热利湿、息风止痉、健脾消疳的功效[1]。近年研究发现，细叶卷柏不仅具有较强的抗氧化、抑制环氧化酶和脂氧化酶的活性[2]，其提取物还具有较强的抗病毒活性，具有直接杀灭病毒和抑制病毒吸附的作用，且细胞毒性较小[3]，因而拥有较高的研究价值和良好的发展前景，未来对于细叶卷柏的需求量定会大增，但细叶卷柏的资源严重不足，已濒临灭绝，而细叶卷柏组织培养研究还没有文献报道。本课题在已知蕨类植物组织培养技术的研究基础上，对细叶卷柏孢子萌发组织培养技术进行研究，为今后细叶卷柏的大规模种植培养提供科学的实验数据。

1材料与方法

1.1材料

细叶卷柏成熟孢子（经湖北中医药大学药学院刘义梅老师鉴定，为卷柏科卷柏属细叶卷柏成熟孢子）

1.2方法

1.2.1外植体的消毒孢子先用水冲洗去泥土，然后用滤纸包裹浸入5%的次氯酸钠溶液或0.1%升汞中5-10min，无菌水冲洗5min，两种消毒方法一样做一份。

1.2.2孢子的接种将消毒后的孢子放入无菌水中，制成孢子悬浮液。吸取少量孢子悬浮液，接种至培养基上，并吸取多余水分，防止污染。孢子萌发使用的培养基为采用不同处理方法处理的孢子萌发培养基，见表1。为了防止污染及接种方便，在培养基上放一块已灭菌的滤纸，将孢子接种至滤纸上。放入光照培养箱中进行培养（培育温度28℃，光周期：光照8h︰黑暗16h）。每组重复接种5份。

2结果与分析

经过15-20d，可见培养基上的孢子有部分变绿，体积变大（见图1）。再经过20-30d，可见部分孢子破裂，形成原叶体。实验发现细叶卷柏孢子在孢子萌发培养基中生长状态良好，体积较大，颜色浅绿，尤其在1/2MS浓度下长势最好（见图2）。另外，细叶卷柏孢子在MS基本培养基中，添加BA及NAA，使得部分孢子长势优秀，体积较大，颜色鲜绿，尤其在11号培养基1/2MS﹢BA(2.0mg/L)﹢NAA(1.0mg/L)中经过50d，大量孢子破裂，形成彼此相连的原叶体（见图3），在10号培养基1/2MS﹢BA(1.0mg/L)﹢NAA(0.5mg/L)也有较好的长势。孢子萌发结果见表2。

表1不同培养基配比

编号培养基MS规格活性炭蔗糖BANAA1孢子萌发培养基MS有30g/L002孢子萌发培养基3/4MS有30g/L003孢子萌发培养基1/2MS有30g/L004孢子萌发培养基1/4MS有30g/L005孢子萌发培养基（无糖）MS有无006孢子萌发培养基（无糖）3/4MS有无007孢子萌发培养基（无糖）1/2MS有无008孢子萌发培养基（无糖）1/4MS有无009孢子萌发培养基1/2MS无30g/L0010孢子萌发培养基1/2MS无30g/L0.5mg/L0.5mg/L11孢子萌发培养基1/2MS无30g/L1.0mg/L0.5mg/L12孢子萌发培养基1/2MS无30g/L2.0mg/L1.0mg/L13孢子萌发培养基1/2MS无30g/L2.0mg/L2.0mg/L14孢子萌发培养基1/2MS无30g/L1.0mg/L1.0mg/L15孢子萌发培养基MS无无无无

注：所用培养基均加7g/L琼脂，pH6.0；培养温度为25℃，光照强度800-1500lx。

表2不同培养基对孢子萌发情况的影响

编号培养基体积大小颜色是否破裂萌发率1孢子萌发培养基较大较绿少量破裂30-40%2孢子萌发培养基大淡黄部分破裂40-45%3孢子萌发培养基较大淡黄少量破裂30-40%4孢子萌发培养基较大较绿少量破裂30-40%5孢子萌发培养基（无糖）较大淡黄少量破裂20-30%6孢子萌发培养基（无糖）大淡黄部分破裂40%7孢子萌发培养基（无糖）较大淡黄少量破裂20-25%8孢子萌发培养基（无糖）较大淡黄少量破裂20%9孢子萌发培养基较大淡黄少量破裂25%10孢子萌发培养基大绿少量破裂30-40%11孢子萌发培养基大绿较多破裂60%12孢子萌发培养基大较绿大量破裂80%以上13孢子萌发培养基较大较绿少量破裂40%14孢子萌发培养基较大绿少量破裂40%15孢子萌发培养基无变化淡黄几乎破裂0%

图1成熟孢子形态

图215-20d部分孢子萌发状态

图350d时11号培养基孢子萌发状态

Chart1matureformofsporeChart2theformofsporein15-20dChart3formofsporein50dof11sample

3讨论与结论

3.1在已经完成的孢子萌发中，我们发现：

①无添加剂无激素的MS培养基对细叶卷柏孢子萌发无作用；

②观察样品我们发现糖的加入不会对细叶卷柏有抑制作用，相反，在缺少糖的培养基中，孢子萌发并不突出；

③对比1-9号孢子萌发培养基中生长的孢子，体积较大，萌发速度较快，但颜色较浅，推测活性炭对细叶卷柏孢子萌发促进作用并不明显；

④在12号培养基1/2MS﹢BA(2.0mg/L)﹢NAA(1.0mg/L)中，孢子长势较好，大孢子破裂，形成原叶体；在11号培养基1/2MS﹢BA(1.0mg/L)﹢NAA(0.5mg/L)也有较好的长势，其他浓度比培养基中的孢子较这两种生长缓慢，推测可能与BA、NAA浓度比有关，为2∶1的培养基对孢子萌发有促进作用。

3.2孢子经过40-50d才破裂萌发，比预期的萌发时间要长，据推测，可能与以下几点有关：

①细叶卷柏是喜阴植物，本课题实验设计的光照时间略长、温度偏高（25℃），可能对孢子萌发有抑制作用；

②外植体消毒使用的消毒剂可能对孢子萌发有影响，升汞有毒性，可能对孢子萌发不利，而采用5%次氯酸钠溶液时，孢子囊有脱色现象发生。

3.3本论文对细叶卷柏组织培养仅是是初步研究，下一步的实验目标，除了完成诱导绿色小球、芽诱导、根诱导等步骤，还将进行活性炭和BA、NAA联合是否对孢子萌发的有所影响，并在展开大量实验，寻找出适合细叶卷柏组织培养的培养基和制定出合理的实验具体操作，为今后大规模培养细叶卷柏提供帮助。

参考文献

[1]中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴第1册[M].北京:科学出版社,1972.

[2]KeliChen,et.al.Antioxidantactivitiesofextractsfromfiveanti-viralmedicinalplants.J.Ethrophannacology,2005(96):201-205

[3]张巧玲,杨占秋,陈科力,等.4种药用植物提取物体外抗柯萨奇病毒B3作用的研究.武汉大学学报（医学版）[J],2005,26(2):157-160.