甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR快速检测及临床意义

甲型H1N1流感病毒实时荧光定量PCR快速检测及临床意义

胡俊忠陈波龚育平张淳轶

张家界市疾病预防控制中心湖南张家界427000

【摘要】目的：对甲型HINI流感病毒实时荧光定量PCR快速检测及其临床意义进行探讨分析。方法：选择2017年7月至2018年6月间甲型H1N1流感患者100例作为此次实验检测对象，应用实时荧光定量PCR技术检测患者发病48小时后及恢复期血浆、咽拭子、下呼吸道分泌物中甲型H1N1流感病毒核酸情况。结果：发病后48小时100例患者咽拭子甲型H1N1流感病毒核酸均阳性；40例重症患者中下呼吸道分泌物甲型H1N1流感病毒核酸阳性23例；40例重症患者中血浆甲型H1N1流感病毒核酸阳性15例。结论：实时荧光定量PCR方法能够对甲型H1N1流感病毒感染进行快速检测，作为重症患者的重要标志之一的血浆甲型H1N1流感病毒核酸检测具有一定临床意义。

【关键词】甲型H1N1流感病毒；实时荧光定量PCR；血浆；快速检测

[Abstract]objective：toexploreandanalyzetherapiddetectionandclinicalsignificanceofreal-timefluorescencequantitativePCRforinfluenzaa（HINI）virus.Methods：100patientswithinfluenzaa（H1N1）fromJuly2017toJune2018wereselectedasthetestsubjects.Real-timefluorescencequantitativePCRtechnologywasappliedtodetectthenucleicacidstatusofinfluenzaa（H1N1）virusinplasma，pharynxswabandlowerrespiratorytractsecretion48hoursaftertheonsetandrecoveryperiod.Results：allthe100patientswithpharyngealswaba（H1N1）influenzavirusnucleicacidwerepositive48hoursafteronset.In40severecases，therewere23casesofpositivenucleicacidofinfluenzaa（H1N1）virussecretioninthelowerrespiratorytract.Plasmaa（H1N1）virusnucleicacidwaspositivein15severecases.Conclusion：real-timefluorescencequantitativePCRcanbeusedforrapiddetectionofinfluenzaa（H1N1）virusinfection.Asoneoftheimportantmarkersofseverepatients，plasmaa（H1N1）influenzavirusnucleicaciddetectionhascertainclinicalsignificance.

[Keywords]a（H1N1）influenzavirus；Real-timefluorescencequantitativePCR；Plasma；Rapiddetectionof

当前实时荧光定量PCR技术广泛应用于甲型H1N1流感病毒核酸检测中，其具有敏感、快速、特异的优势。依据呼吸道病毒侵袭特点，早期病变局部病毒浓度较高，病情进展过程中血液中会侵入病毒，形成毒血症，所以应用实时荧光定量PCR技术对血液中甲型H1N1流感病毒核酸进行检测，有利于病毒血症的临床监测，为医生判断疾病严重程度提供依据[1]。本研究选择甲型H1N1流感患者100例作为检测研究对象，对其开展实时荧光定量PCR检测，现报告如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选择我市流感监测定点医院2017年7月至2018年6月间收治的甲型H1N1流感患者100例，患者均满足HIN1流感诊断标准，实验室确定咽拭子甲型H1N1流感病毒核酸阳性，其中40例重症患者满足重症与危重病例诊断标准。其中包括女46例、男54例；年龄范围5~43岁，平均（32.2±2.5）岁。

1.2方法

1.2.1采集标准发病后48小时、恢复期采集患者咽拭子，同时取1ml外周血，加入乙二胺四乙酸二甲抗凝。应用真空吸引术吸取40例重症患者下呼吸道分泌物，同时进行外周血液标本采集。在零下4℃冰箱中保存咽拭子标本，离心血液标本获取血浆，在零下70℃冻存，24小时内检测。

1.2.2实验室检测选择江苏硕世生物科技股份有限公司提供的双荧光探针、甲型H1N1流感病毒（2009）核酸检测试剂盒。应用磁珠提取法提取下呼吸道分泌物、咽拭子、血浆中核酸。扩增的循环参数：逆转录反应50摄氏度30分钟，预变性95摄氏度5分钟，预扩增1个循环；变性95摄氏度10秒钟，退火、延伸及检测荧光55摄氏度40秒钟，扩增45个循环。FAM和VIC通道为检测通道，前者为H1N1RNA信号，后者为甲型流感病毒RNA信号[2]。

1.3数据处理

应用Microsoftoffice2016版Excel软件对本次研究数据进行统计分析，其中计数资料用n或%表示。

2结果

2.1结果判断

Ct>38或无数值样本为阴性，Ct≤35为阳性，35<Ct≦38需重复检测。

2.2发病后48小时甲型H1N1流感病毒RNA阳性率

100例咽拭子标本经实验室确认甲型H1N1流感病毒RNA检测结果全部为阳性，重症患者和轻症患者咽拭子中病毒RNA阳性率对比差异无统计学意义（P>0.05）；下呼吸道分泌物病毒RNA检测结果为阳性的气管插管重症患者23例；100例血浆中结果为阳性15例，全部为重症患者，重症患者阳性率37.5%，与轻症患者血浆病毒RNA阳性率对比差异有统计学意义（P<0.05）。详细数据见下表1。

表1：发病48小时后甲型H1N1流感病毒RNA阳性率[n（%）]

3讨论

甲型H1N1流感为临床常见传染病，对于该型病毒人类缺乏免疫力，在各种因素影响下甲型H1N1流感病毒阳性患者会具有不同的临床表现、预后，对于其病情进行较难预测[3]。实施荧光定量RT-PCR技术当前被广泛应用于基因表达定量检测，其具有敏感度高、程序结束后无需处理等优势[4]。本研究应用该技术检测下呼吸道分泌物、咽拭子、血浆中甲型H1N1流感病毒RNA，并对不同标本病毒RNA检测结构预测病情进行探讨，结果显示甲型H1N1流感重症、病情进展的重要指征之一就是血浆中病毒RNA阳性。

实时荧光定量RT-PCR检测显示，发病后48小时、恢复期轻症患者血浆中病毒RNA均为阴性，而重症患者发病后48小时血浆病毒RNA具有37.5%阳性率，恢复期阳性有2例。通常情况下流感病毒在血浆中很少能检测到，提示甲型H1N1流感的重症及预后差重要标志包括血浆中H1N1病毒RNA阳性[5]。临床研究认为，可通过甲型H1N1流感患者康复后血浆输注对重症甲型H1N1流感感染者进行治疗，但需检测供体血浆H1N1核酸，以保证生物安全[6]。

综上所述，实时荧光定量PCR方法能够对甲型H1N1流感病毒感染进行快速检测，重症患者的重要标志之一就是血浆中甲型H1N1流感病毒核酸阳性。

参考文献：

[1]张烜榕，赵曰水，侯敏.昆明市2009～2010年甲型H1N1流感病毒网络实验室的监测结果分析[J].现代预防医学，2017，39（21）：5529-5531.

[2]卢桂兰，彭晓旻，梁慧洁.儿童甲型H1N1流感和季节性流感患者的病毒载量及相关临床症状研究[J].国际病毒学杂志，2016，18（02）：36-40.

[3]杨成林.荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的对比分析[J].中国保健营养（下旬刊），2016，22（01）：32-33.

[4]陆柔剑，张陵林，谭文杰.甲型H1N1流感病毒感染患者中人冠状病毒和人偏肺病毒感染情况的初步分析[J].中国急救医学，2017，30（02）：102-104.

[5]张弘，何永强，张严峻.单管多重荧光定量RT-PCR方法鉴别新甲型H1N1及甲型和乙型流行性感冒病毒[J].中华预防医学杂志，2017，46（03）：273-276.

[6]张洪英，祈贤，杜雪飞.甲型H1N1流感病毒实时荧光RT-PCR检测法的建立及其在南京地区甲流防控早期的应用[J].现代预防医学，2015，38（01）：131-134.