显微镜下人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立

显微镜下人胃癌裸鼠原位移植和转移模型的建立

林奇陈慧玉

林奇陈慧玉（连云港市第一人民医院普通外科江苏连云港222002）

【摘要】目的显微镜下建立一种能很好模拟人体内生物学行为的胃癌裸小鼠原位移植和转移模型。方法采用人胃癌SGC-7901细胞株在裸鼠皮下反复传5代形成实体瘤，显微镜下将人胃癌裸鼠皮下移植瘤块种植于裸小鼠胃壁，建立胃癌裸小鼠原位移植和转移模型16个，观察建立的模型肿瘤生长状况、移植成功率和自发转移的发生率，常规HE染色，观察胃癌原位移植瘤、胃癌淋巴结转移和肝转移的病理切片，电镜下观察肿瘤超微结构。结果胃癌裸鼠皮下移植瘤原位移植的原位成瘤率达100％（16/16），淋巴结广泛转移率为87.5%(14/16)，肝转移发生率为75％(12/16)，腹水形成率为12.5%(2/16)。结论显微镜下建立原位移植和转移模型成功率高，且具有人胃癌自然生长过程的特点和生物学活性。

【关键词】胃肿瘤肿瘤细胞原位移植疾病模型裸小鼠

【中图分类号】R73-35【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）31-0110-03

Theestablishmentoforthotopicimplantandmetastaticmodelsofhumanstomachcancerinnudemiceunderthemicroscope

LINQi,CHENHui-yu

(DepartmentofGeneralSurgery,TheFirstHospitalofLianyungangCity，Lianyungang,222002，China)

【Abstract】ObjectiveTodevelopanudemousemodelofhumangastriccancerwhichcanmimicitsnaturalhumanbiologicactivitiesunderthemicroscope.MethodsHumangastriccancerSGC-7901wasculturedinnudemicerepeatedlyfor5generationstogettheTumorsubcutaneoussolidtumor,whichwasthenemulsifiedandorthotopiclyimplantedintothenudemousestomachunderthemicroscopetodevelop16implant-tumors.Thetumorgrowthcharacteristic,tumor-takeratesandmetastaticrateswereanalyzedgrossly.Thegastricorthotopicallytransplantation,gastriccancerlymphaticmetastasisandhepaticmetastasisbyHEstaining,theultrostructures,byelectronmicroscopywereanalyzedtoo.ResultsThetumor-takeratewas100％,themetastasesoflymphnodesandliverswere87.5％and75％,ascitesformationis12.5%.ConclusionTorepeatthemodelunderthemicroscopeiseasyandqualified,whichcanexhibitingnaturalgrowthcharactersandbiologicalactivitiessuccessfully.

【Keywords】stomachneoplasmstumorcellsorthotopicthansplantationdiseasemodelnudemouse

理想的人类肿瘤动物模型的建立是研究肿瘤生长和转移生物学以及寻求抗癌新药和新方法的重要工具。本研究采用显微镜下建立人胃癌裸鼠原位移植模型，具有在局部呈浸润性生长、局部或远处有肿瘤转移，为胃癌的研究提供了一个很好的载体。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1SPF(specialpathogenfree)实验室按国家标准配备集中通风笼架和独立通风笼盒系统、超净工作台。室内和笼盒内温度保持在22-24℃，日温差<1℃、相对湿度45-65%、压强梯度22Pa，空气清洁度10000级，噪声<55dB、照度15-20LX、昼夜明暗交替12L-12D。选择Co60辐照灭菌的全价营养配合颗粒饲料与高温高压灭菌水，每周更换笼具。实验器材以高温高压消毒。

1.1.2实验动物BALB/C/nu/nu裸小鼠（中科院国家啮齿类上海实验分中心），繁育自无特殊致病原（SPF）级实验动物屏障环境。合格证：中国科学院动物管理委员会001号，上海市动管会二级机构证书。雌雄兼用，5-6周，体重17±2.5g，实验共用120只，分笼饲养（每笼5只）。实验过程中均在SPF屏障环境内饲养。实验前一周购入小鼠，使其适应新环境。

1.1.3瘤株人胃腺癌SGC-7901细胞株（中科院上海细胞生物研究所）。癌细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，于CO2恒温孵育箱中培养，常规传代。

1.2方法

1.2.1人胃癌皮下移植瘤模型的建立收集体外培养的SGC-7901细胞，使细胞含量每毫升为2×107个，取0.1ml注入裸小鼠颈部皮下形成实体瘤。至肿瘤直径1.5cm左右时，处死裸小鼠，切取肿瘤放入生理盐水（含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素）中，去除包膜，选择近边缘新鲜组织大约1mm3以粗针穿刺接种于另一只小鼠，每次传代4只，反复传5代后作为原位移植用瘤源。

1.2.2原位移植模型的建立（显微手术法）裸小鼠术前禁食12h，以0.6％戊巴比妥钠腹腔内注射（50mg/kg）麻醉。常规消毒皮肤，取上述传5代后生长3周左右处于对数生长期的荷瘤鼠，常规消毒，从颈部皮下剥取肿瘤组织，剔出纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，剪成1mm×1mm×1mm小块，手术显微镜放大10倍下操作，取上腹正中切口，以8-0丝线穿过浆肌层将上述一块瘤组织荷包缝扎在刮破浆膜的胃大弯前壁，荷包直径约0.4cm。分层关腹。术后精心饲养，每日观察一到二次，每周称一次体重。

1.2.3光镜和电镜观察肿瘤形态学肿瘤组织（包括肝脏和淋巴结）以10%中性甲醛固定24h后，脱水，石蜡包埋。实验时4µm切片，苏木精和伊红常规染色。光镜下观察；锐刀将标本切成1mm3的小块，以2.5%戊二醛和1%锇酸双固定，低度乙醇脱水，用Epon812常规方法包埋，制成半薄切片，甲苯胺蓝染色，光镜下定位。超薄切片机切片，醋酸双氧铀柠檬酸双染色，透射电镜下观察细胞超微结构并摄片。

2结果

2.1人胃癌组织块原位移植瘤的生长情况移植术后3～4周左右于左上腹部可扪及直径约2～3mm质地较硬的结节，随后肿瘤结节逐渐生长增大，5～7周时上腹部可扪及较明显的肿块，同一组荷瘤鼠肿瘤结节的大小略有差异。8～10周时，上腹部肿块的直径可达1.0～1.5cm，大部分动物消瘦明显，活动欠佳。以后瘤体继续增大，腹部可见巨大瘤体突起，动物极度消瘦、倦怠，对周围刺激反应差（图一），逐渐出现全身衰竭和死亡。荷瘤鼠一般的生存时间为12～15周，中位生存期13.5周。本组16个模型胃癌裸鼠皮下移植瘤原位移植的原位成瘤率达100％（16/16），淋巴结广泛转移率为87.5%(14/16)，肝转移发生率为75％(12/16)，腹水形成率为12.5%(2/16)。

2.2大体解剖观察打开腹腔去除胃周围组织可见：看不到完整的胃壁，被肿瘤组织完全占据，表面呈结节状，高低不平，触及质地较硬，切面均质，鱼肉状，瘤体较大时中央有坏死区。胃壁肿瘤与网膜粘连，部分动物瘤体与肝、脾及腹壁粘连，大部分动物腹腔内淋巴结肿大（图二），部分荷瘤鼠肝脏中见有灰白色结节，少数动物腹腔内有少量腹水。

2.3光镜下观察光镜下胃移植瘤细胞多呈椭圆形、核大、畸形、深染。瘤细胞排列呈巢状或索状，无明显腺体结构存在，在胃壁中浸润性生长（图三）。转移淋巴结内被癌细胞所充填，并破坏其组织结构，发展成转移癌结节（图四）。肝脏转移癌灶的组织学形态结构与胃移植瘤相一致，多在肝实质的血管周围形成，部分转移癌灶的瘤细胞在肝组织中呈浸润性生长，且已经形成自身的较粗的血管系统（图五）。

2.4透射电镜下观察透射电镜下可见微绒毛突入细胞间隙，在许多紧密连接的细胞间能找到紧密连接、桥粒和缝隙连接。细胞内细胞器很丰富，以线粒体、粗面内质网、游离核糖体为多（图六）。

图一图二图三

图一衰竭鼠倦怠、对周围刺激反应差

图二人胃腺癌SGC-7901裸鼠原位移植模型

图三原位移植人胃腺癌SGC-7901肿瘤组织学表现（HE×100倍）

图四图五图六

图四人胃癌裸鼠原位移植瘤淋巴结转移组织学表现（HE×400倍）

图五人胃癌裸鼠原位移植瘤肝转图移组织学表现（HE×100倍）

图六电镜下人胃癌裸鼠原位移植瘤细胞

3讨论

一个很好的胃癌动物模型应该具备肿瘤在局部呈浸润性生长、局部或远处有肿瘤转移以及微转移的存在[1]。要建立能很好的模拟人癌恶性生物学行为的移植模型，必须使用具有转移潜能的瘤细胞，还必须让其在相应的器官环境中生长。目前文献报道多采用SGC7901细胞系，小鼠以先天遗传突变致胸腺发育不全的纯合裸小鼠（nu/nu)最为理想[2]。裸鼠移植瘤较好地保持了原发肿瘤的形态功能和生物学特性，被称为研究人类肿瘤的“活试管”。

在本研究中，使用经裸鼠皮下反复传代的组织块移植于裸鼠胃壁，成功建立了16个人胃癌原位移植模型，并观察了小鼠的自然生长过程。实验结果表明：皮下组织块原位移植建立的模型，局部成瘤率达100％，濒临死亡的裸小鼠解剖观察，腹腔均发生广泛转移，且肝脏转移率较高。而Furukawa[3]等发现细胞悬液原位种植后，局部成瘤率和转移发生率较皮下移植块原位移植法低，且生长较皮下移植块法慢2～3周。皮下移植块原位移植的模型淋巴结转移较广泛，肝脏转移的发生率也较高。这可能是皮下传代的肿瘤细胞更能适应胃壁的生长环境，从而对其侵袭和转移等生物学行为影响也最小，就如“在同样的土壤上原位移植块是最优秀的种子，就能结出最好的果实”。而细胞悬液法可能是肿瘤细胞经酶消化处理后，细胞表面结构遭破坏发生变化，导致了恶性肿瘤生物学行为和自然属性的改变，结果影响了肿瘤细胞的生长和转移[4]。

因此，我们认为皮下移植块原位移植法具有成瘤率较高、淋巴结转移较广泛、肝脏转移发生率也高等特点，重现了人胃癌的临床病理和生理过程。该模型的建立为人胃癌转移机制与抗转移治疗的研究提供了一种有价值的工具。

参考文献

[1]IllertB，OttoC，BraendleinS，etal.Optimizationofametastasizinghumangastriccancermodelinnudemice[J].Microsurg，2003，23(5)：508-512.

[2]RygaardJ.Heterotransplantationofahumanmalignanttumortonudemice[J].ActaPatholMicrobiolScan，1969，77(4)：758-760.

[3]FujiharaT，SawakaT，ChungKH，etal.Establishmentoflymphnodemetastaticmodelforhumangastriccancerinnudemiceandanalysisoffactorsassociatedwithmetastases[J].ClinExpmetastasis，1998，16(4)：389-398.

[4]FurukawaT，FuX，KubotaT，etal.Nudemousemetastaticmodelsofhumanstomachcancerconstructedusingorthotopicimplantationofhistologicallyintacttissue[J].CancerRes，1993，53(5)：1204-1208.