基于TaqMan-TAMRA探针技术的ApoE基因快速分型方法研究

基于TaqMan-TAMRA探针技术的ApoE基因快速分型方法研究

何骏奇1,2任峻2王桢媚2卢大儒1

何骏奇1,2任峻2王桢媚2卢大儒1

（1复旦大学生命科学学院上海杨浦200433）

（2上海星健生物科技有限公司上海闸北200070）

【摘要】目的建立基于TaqMan-TAMRA探针技术的快速、准确的载脂蛋白E(ApoE)基因型检测方法，为临床诊断、治疗和预防ApoE基因相关疾病提供依据。方法对1049例血液样本提取DNA后，利用TaqMan-TAMRA探针对ApoE基因进行检测和分型，并利用测序法进行验证。结果1049例样本中，共检出1048例，ApoE基因的6种基因型（ε3/ε3、ε2/ε3、ε3/ε4、ε2/ε4、ε2/ε2、ε4/ε4）所占比例分别为68.64%、13.54%、14.97%、1.72%、0.76%、0.38%。TaqMan-TAMRA探针法分型结果与测序结果完全一致。结论TaqMan-TAMRA探针法操作简便，分型结果准确度高，是一种适用于临床的ApoE基因快速分型方法。

【关键词】载脂蛋白ETaqMan-TAMRA基因分型测序

【中图分类号】R319【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）35-0132-02

DevelopmentofafastgenotypingforApoEbasedonTaqMan-TAMRAprobes

【Abstract】Objective:ToestablishamethodforfastandaccurategenotypingApoEwithTaqMan-TAMRAprobesandtosupporttheclinicaldiagnosis、treatmentandprevention.Methods:DNAwasextractedfrom1049bloodsamples,thendetectedandgenotypedwithTaqManTAMRAprobes.Thegenotypeswerecomparedwithsequencingresults.Results:DNAweredetectedin1048outof1049samples.Ofwhich,sixgenotypesofApoEgene(ε3/ε3,ε2/ε3,ε3/ε4,ε2/ε4,ε2/ε2,ε4/ε4)accountedfor68.64%,13.54%,14.97%,1.72%,0.76%,0.38%.TaqMan-TAMRAprobegenotypeswereconsistentwithsequencingresults.Conclusion:TaqMan-TAMRAisafastandaccuratemethodforgenotypingApoE.

【Keywords】ApolipoproteinETaqMan-TAMRAgenotypingsequencing

载脂蛋白（ApoE）基因位于人的第19号染色体，编码由299个氨基酸组成的ApoE蛋白，该蛋白具有脂蛋白转运、代谢及修复细胞膜等功能[1，2]。由于ApoE基因存在一些突变位点，因此会产生不同的等位基因，在人群中表现出遗传多态性。ApoE基因有3种最为常见的等位基因即ε2、ε3、ε4，对应蛋白分别为E2（112Cys;158Cys）、E3（112Cys;158Arg）、E4（112Arg;158Arg），其区别在于氨基酸序列上的两个位点。3种等位基因共产生6种基因型，分别为ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4，其中ε3/ε3在人群中所占比例最大，因ApoE基因型不同，其对应的生物学功能也出现较大差异[3]。研究表明，ε2/ε2可能与Ⅲ型高脂血症有关，而ε4基因型频率升高可能引起阿尔茨海默病、动脉粥样硬化等疾病[4-5]。因此，在临床上对ApoE基因进行分型具有十分重要的意义。

目前对ApoE基因进行分型的方法主要有扩增阻滞突变系统PCR（AmplificationrefractorymutationsystemPCR,ARMS-PCR）[6-8]、PCR-单链构象多态性（PCR-single-strandconformationpolymorphism,PCR-SSCP）[9]、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RestrictionFragmentLengthPolymorphism，PCR-RFLP）[10]等，但由于这些方法操作复杂，结果不易分析，或者准确性有待提高，因此不适用于临床。测序法是临床基因检测的黄金标准，虽然较为准确，但操作过程繁琐，因此也不能满足临床上对ApoE基因进行快速分型的要求。本研究以TaqMan-TAMRA探针技术为基础，对ApoE基因的2个SNP位点分别设计引物及TaqMan-TAMRA探针,对样本进行ApoE基因分型，并利用测序法进行验证，建立了一种快速、准确的ApoE基因分型方法。

1材料与方法

1.1材料

样本来自上海星健生物科技有限公司健康体检者，共1049例。样本类型为EDTA抗凝全血，-20℃保存备用。

1.2仪器和试剂

1.2.1主要仪器

ABI7900荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；EppendorfBioSpectrometer分光光度计（德国Eppendorf公司）；Eppendorf5810离心机（德国Eppendorf公司）。

1.2.2主要试剂

血液基因组提取试剂盒(DP318)(天根公司)；引物、探针及反应预混液（上海基康公司），其他试剂（上海基康公司）。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取

采用天根公司血液基因组提取试剂盒(DP318)提取基因组DNA，提取方法参照试剂盒说明书。DNA经过浓度、纯度检测合格后，方可用于后续实验。

1.3.2TaqMan-TAMRA探针法检测方案

从美国国立生物技术信息中心（NCBI）下载ApoE基因序列，针对ApoE基因及其两个SNP位点，分别设计特异性性引物和特异性TaqMan-TAMRA探针。使用BeaconDesigner7软件设计引物及探针，引物及探针序列见表1。

检测SNP1位点（对应第112位氨基酸）的特异性引物对及探针分别为Primer1、Primer2、Probe1、Probe2；探针Probe1、Probe2的5′端分别标记FAM（FAM-1a）、VIC（VIC-1b）荧光基团,3′端均标记TAMRA淬灭基团。检测SNP2位点（对应第158位氨基酸）的特异性引物对及探针分别为：Primer3、Primer4、Probe3、Probe4，探针Probe3、Probe4的5′端分别标记FAM（FAM-2a）、VIC（VIC-2b）荧光基团,3′端均标记TAMRA淬灭基团。

表1实验所涉及的引物及TaqMan-TAMRA探针

由于ApoE基因有2个SNP位点，因此采用双管法来进行检测。探针Probe1、Probe2和引物Primer1、Primer2组成一组，用来检测SNP1；探针Probe3、Probe4和引物Primer3、Primer4组成一组，用来检测SNP2。反应体系为10ul，各组分分别为：2×MasterMix5.0ul，正反向引物（20pmol/ul）各0.45ul，探针(10pmol/ul)各0.25ul，模板DNA（(10ng/ul)）1.0ul，无菌水2.6ul。反应在ABI7900PCR仪中进行。SNP1反应程序为：95℃预变性10min，92℃变性15s，60℃退火1min，60℃延伸1min，20个循环；SNP2反应程序为：95℃预变性10min，89℃变性15s，60℃退火1min，60℃延伸1min30s，30个循环。仪器自动运行并搜集荧光信号，通过分析软件进行终点判读，综合两管分型结果，判定样本的ApoE基因型。

1.3.3测序法验证分型结果

所有样本DNA经过PCR扩增，产物纯化后送上海生工生物工程股份有限公司进行DNA测序。扩增引物参照文献[11]合成。获得测序数据后对结果进行分析，确定ApoE的基因型，用来验证TaqMan-TAMRA探针法的分型结果。

2结果

2.1TaqMan-TAMRA法分型结果

采用TaqMan-TAMRA探针技术建立的检测方法，对1049个样本进行检测。反应结束后利用终点法进行结果判定（图1）。

经过统计，共有1048个样品被检出（见表2），1例检测失败，检出率99.90%。所有样本基因型共有6种：ε2/ε2型8例，占0.76%；ε2/ε3型142例，占13.54%；ε2/ε4型18例，占1.72%；ε3/ε3型720例，占68.64%；ε3/ε4型157例，占14.97%；ε4/ε4型4例，占0.38%。

图1TaqMan-TAMRA探针法分型结果

2.2测序法验证结果

以测序结果为金标准，与测序结果一致的判定为分型正确，与测序结果不一致的判定为分型错误，用正确分型人数占所有分型人数的百分比表示准确度。对1049份样本进行DNA测序，所有样本均测出结果（见图2）。

图2测序法分型结果

经过统计，除1份样本用TaqMan-TAMRA探针法无法检测出结果外，其余1048份样本ApoE基因分型结果与测序结果完全一致（表2）。1份样本检测失败不计入统计，则TaqMan-TAMRA探针法对ApoE基因分型准确度为100%。

表2两种检测方法比较

3讨论

ApoE基因最常见基因型共6种，而不同的基因型对应着不同表型[3]。近年来，越来越多的研究表明，ApoE基因可能与心血管病[12]、阿尔茨海默病[13]、认知损伤[14]、免疫应答[15]等有关。因此，临床检测ApoE基因型具有十分重要的意义。

目前ApoE基因分型方法主要有ARMS-PCR法、PCR-SSCP、PCR-RFLP法等，以测序法为金标准，三种方法准确度分别为99.2%、98.5%、99.8%，其准确度仍然不能完全满足临床需要[16]；测序法由于其结果准确，目前是临床检测的黄金标准，但由于其步骤繁琐，耗费时间较长，因此也限制了临床快速检测的应用。本研究建立的ApoE基因快速分型方法基于TaqMan-TAMRA技术，由于TaqMan-TAMRA技术十分成熟，十分适合临床应用；另外本研究设计的双管法可以同时对两个SNP位点进行检测，并且利用终点法判定分型结果，仅在反应结束后进行分析判读，节省了大量时间，十分快速、方便。本研究利用测序法对TaqMan-TAMRA法分型结果进行了验证，比较结果显示二者分型结果完全一致，说明TaqMan-TAMRA法可以完全代替测序法应用在临床ApoE基因检测上。

与其他方法相比，本研究建立的TaqMan-TAMRA法具有快速、简便、准确的特点，十分适用于临床ApoE基因分型，值得推广。

参考文献

[1]MahleyRW.ApolipoproteinE:cholesteroltransportproteinwithexpandingroleincellbiology[J].Science,1988,240(4852):622-630.

[2]PoirierJ.ApolipoproteinEinanimalmodelsofCNSinjuryandinAlzheimer'sdisease[J].TrendsNeurosci,1994,17(12):525-530.

[3]ZannisVI,BreslowJL,UtermannG,etal.ProposednomenclatureofapoEisoproteins,apoEgenotypes,andphenotypes[J].JLipidRes,1982,23:911-914.

[4]DavignonJ,GreggRE,SingCF.ApolipoproteinEpolimorphismandatherosclerosis[J].Arteriosclerosis,1988,8(1):1-21.

[5]SauudersAM,SchmaderK,BreitnerJC,etal.Apolipoproteinε4alleledistributionsinlate-onsetAlzheimer’sdiseaseandinotheramyloid-formingdisease[J].Lancet.1993,342:710-711.

[6]MainBF,JonesPJ,MacGillivrayRT,etal.ApolipoproteinEgenotypingusingthepolymerasechainreactionandallele-specificoligonucleotideprimers[J].JLipidRes,1991,32(1):183-187.

[7]李晓宁,肖劲松.一种新型ApoE基因多态型检测方法[J].数理医药学杂志,2002,15(2):106-106.

[8]李冬梅,王玉明,刘华等.多重引物等位特异PCR法快速检测ApoE基因型的研究[J].昆明医学院学报,2008,29(1):69-72,94.

[9]胡鹏,覃远汉,经承学等.PCR-SSCP法分析载脂蛋白E基因多态性[J].皖南医学院学报,2006,25(2):97-98,104.

[10]RichardP,ThomasG,deZuluetaMP,etal.CommonandraregenotypesofhumanapolipoproteinEdeterminedbyspecificrestrictionprofilesofpolymerasechainreaction-amplifiedDNA[J].ClinChem,1994,40(1):24-29.

[11]WuK,BowmanR,WelchAA,LubenRN,etal.ApolipoproteinEpolymorphisms,dietaryfatandfibre,andserumlipids:theEPICNorfolkstudy[J].EurHeartJ.2007;28(23):2930-2936.

[12]Kathiresan,S.,Melander,O.,Anevski,D.,etal.Polymorphismsassociatedwithcholesterolandriskofcardiovascularevents[J].NewEng.J.Med,2008,358:1240-1249.

[13]Agosta,F.,Vossel,K.A.,Miller,B.L.,etal.ApolipoproteinEepsilon-4isassociatedwithdisease-specificeffectsonbrainatrophyinAlzheimer'sdiseaseandfrontotemporaldementia[J].Proc.Nat.Acad.Sci,2009,106:2018-2022.

[14]vanVliet,P.,Oleksik,A.M.,etal.APOEgenotypemodulatestheeffectofserumcalciumlevelsoncognitivefunctioninoldage[J].Neurology,2009,72:821-828.

[15]vandenElzen,P.,Garg,S.,Leon,L.,etal.Apolipoprotein-mediatedpathwaysoflipidantigenpresentation[J].Nature,2005,437:906-910.

[16]熊燏,钱士匀.载脂蛋白E基因三种分型检测方法临床效能对比评价[J].检验医学,2013,28(9):789-792.