中药植物雌激素对人晶状体上皮细胞雌激素受体表达的影响与信号转导机制研究

中药植物雌激素对人晶状体上皮细胞雌激素受体表达的影响与信号转导机制研究

廖路妹张小兰

（广州市番禺区大石街社区卫生服务中心广州440113）

【摘要】目的：研究中药植物雌激素对人晶状体上皮细胞（HLEC）雌激素受体（ER）表达的影响并分析其信号转导机制。方法：应用中药植物雌激素蜕皮甾酮（ECR）与人晶状体上皮细胞共同孵育，采用雌二醇（E2）作为本次研究阳性对照，在应用过氧化氢对人晶状体上皮细胞形成氧化损伤，应用流式细胞术（FCM）检测雌激素受体蛋白其表达受不同浓度（10-6、10-7、10-8mol/L）蜕皮甾酮的影响。结果：随着蜕皮甾酮浓度上升，其ERα、ERβ蛋白逐渐上升，表现出明显的浓度依赖相关。结论：中药植物雌激素蜕皮甾酮可能机制是上调由过氧化氢处理的人晶状体上皮细胞其雌激素受体表达继而发挥抗氧化损伤机制，从而达到防治年龄相关性白内障作用。

【关键词】中药植物雌激素；人晶状体上皮细胞

【中图分类号】R776.1【文献标识码】C【文章编号】1004-6194（2015）02-0398-02

【Abstract】Objective:tostudythetraditionalChinesemedicineplantestrogensinhumanlensepithelialcells(HLEC)theinfluenceofestrogenreceptor(ER)expressionandanalyzeitssignaltransductionmechanism.Methods:thetraditionalChinesemedicineplantestrogenmoltingsteroneandhumanlensepithelialcells(ECR)commonincubation,theestradiol(E2)aspositivecontrol,thestudyonapplicationofhydrogenperoxideinhumanlensepithelialcellsformoxidativedamage,flowcytometry(FCM)isappliedtodetecttheestrogenreceptorproteinexpressionbydifferentconcentrations(10-6,10-7,10-8mol/L)moltingsteroneinfluence.Results:AndwiththisriseofsteroneanditsERalpha,betaproteinERgraduallyrise,showingobviousconcentrationdependent.Conclusion:Chinesemedicineplantestrogenmoltingsteronepossiblemechanismisraisedbyhydrogenperoxidetreatmenthumanlensepithelialcellsoftheestrogenreceptorexpressionandthenplayagainstoxidativedamagemechanism,soastoachievethepreventionandtreatmentofage-relatedcataract.

【keywords】traditionalChinesemedicineplantestrogen;Humanlensepithelialcells

作为从中老年开始进展发生的晶状体混浊，老年性白内障随着年龄增加其患病率也显著上升[-2]。蜕皮甾酮（ECR）是中成药牛膝的有效单体成分，本次研究从雌激素受体相关角度对蜕皮甾酮对氧化应激状态下人晶状体上皮细胞的影响及其信号转导机制作出讨论，探讨老年白内障发病机制及防治办法。

1材料与方法

1.1使用仪器流式细胞仪、二氧化碳培养箱、超低温冰箱、微量移液器、倒置相差显微镜、超净工作台。

1.2主要试剂雌二醇(E2)粉末，纯度97%；蜕皮甾酮(ECR)粉末，纯度96.3%,；胰蛋白酶，DMEM培养基干粉；兔抗人ERα、ERβ多克隆抗体,异硫氰酸荧光素(HTC)标记的羊抗兔抗体。

1.3实验方法

1.3.1人晶状体上皮细胞培养将冷冻保存去冻存管内的细胞取出后置入37摄氏度水内，使用十倍体积以上的培养液将溶解的细胞悬液予以稀释、离心、上清液去除，并反复洗涤三次。在培养瓶中以每毫升5*105个计量接种，于30摄氏度5%CO2培养箱中培养。传代培养工作在细胞生长融合后开始。

1.3.2溶液配制雌二醇溶液配制：取雌二醇粉末0.0136克，在五毫升无水乙醇中溶解，配成102mol/L的储存液，于使用前进行稀释。反应缓冲液配制：称取牛血清白蛋白2.5克，在200毫升磷酸盐缓冲液内溶解备用。

1.3.3分组及给药对照组：晶状体上皮细胞+含10%新生牛血清的达尔伯克改良伊格尔（DMEM）培养液；过氧化氢组：对照组配液+3*104mol/L的过氧化氢；雌二醇组：过氧化氢组配液+108mol/L雌二醇；蜕皮甾酮高浓度组：过氧化氢组配液+106mol/L蜕皮甾酮；脱皮甾酮中浓度组：过氧化氢组配液+107mol/L蜕皮甾酮；蜕皮甾酮低浓度组：过氧化氢组配液+108mol/L蜕皮甾酮；

1.3.4应用流式细胞术（FCM）对由过氧化氢处理后的人晶状体上皮细胞内ERα、ERβ蛋白的表达情况进行检测，用磷酸盐缓冲溶液进行一次洗涤，各组设立七个平行样本；-20℃二十分钟的固定主要应用-20℃预冷的百分之百甲醇；用磷酸盐缓冲溶液进行两次洗涤，十分钟的室温处理应用4℃预冷的核分离液，随后用反应缓冲液进行两次洗涤；加入内含1%牛血清白蛋白与1%NCS的磷酸盐缓冲溶液50微升，充分混匀后三十分钟室温放置；随后用反应缓冲液进行两次洗涤，依次加入1:100稀释的一抗，在四摄氏度下反应过夜，随后用反应缓冲液进行两次洗涤。然后用反应缓冲液洗涤2遍；加入1∶50稀释的异硫氰酸荧光素标记的二抗，置冰上避光放置30min；随后用反应缓冲液进行两次洗涤，加入1毫升PBS悬浮细胞，上机做流式细胞分析，对ERα、ERβ蛋白阳性率进行检测。

1.4统计学处理应用统计学软件SPSS17.0进行分析，数据均以X±S表示，多组均数比较用ONE-WAYANOVEA方法，P＜0.01，差异明显，具有统计学意义。

2结果

经检测发现，正常人晶状体上皮细胞中有ERα蛋白的表达；过氧化氢组内人晶状体上皮细胞ERα蛋白表达显著降低，同对照组相比，P＜0.01，差异明显具有统计学意义。具体见表1:

表1流式细胞术检测不同浓度蜕皮甾酮对过氧化氢处理后的人晶状体上皮细胞内ERα、ERβ蛋白表达影响

组别ERαERβ

对照组33.552±2.14727.208±1.633

过氧化氢组21.428±1.491*15.702±0.613*

雌二醇组31.470±1.536#25.478±0.906#

蜕皮甾酮高浓度组37.312±1.013#30.793±2.022#

蜕皮甾酮中浓度组33.295±1.996#26.745±3.142#

蜕皮甾酮低浓度组27.593±0.844#20.143±0.551#

3讨论

不同原因和机制引起的晶状体自由基其产生及清除系统失调，都会导致人晶状体上皮细胞及周围组织的氧化耗损，继而引发有晶状体变浑浊而导致的年龄相关性白内障。本次研究通过应用过氧化氢对人晶状体上皮细胞氧化损伤模式，联合应用具有抗氧化损伤的雌二醇及中药植物雌激素蜕皮甾酮进行抗氧化损伤机制研究，发现雌激素主要通过与其雌激素受体结合而发挥其生物学功能。雌激素受体是类固醇激素受体家族中的一类，有两种雌激素受体在人体内表达，主要是ERα、ERβ蛋白。有相关研究报告已证实人晶状体上皮细胞存在雌激素受体的表达[3]。本次研究通过流式细胞术检测亦发现正常人晶状体上皮细胞有两种受体的表达，这同上述研究报告结果相符[4]。

综上，中药植物雌激素蜕皮甾酮可能机制是上调由过氧化氢处理的人晶状体上皮细胞其雌激素受体表达继而发挥抗氧化损伤机制，从而达到防治年龄相关性白内障作用。

参考文献：

[1]刘思源，康刚劲．不同浓度17β-雌二醇对雌性大鼠晶状体上皮细胞凋亡的影响［J］．眼科新进展，2011,31（8）：725-729.

[2]冯春燕，黄秀榕，祁明信，等．蜕皮甾酮对H2O2诱导氧化损伤的人晶状体上皮细胞核因子κBp65表达的影响［J］．中国中西医结合杂志，2012，32(1):76-79．

[3]殷英霞，宋秀君，刘金玲，等．雌雄激素对去势雌鼠晶状体氧化代谢的影响［J］．中华实验眼科杂志，2011,29（2）：151-154.

[4]FlynnJM,DimitrijevichSD,YounesM,etal.Roleofwildtypeestrogenreceptorbetainmitochondrialcytoprotectionofculturednormalmaleandfemalehumanlensepithelialcells[J].AmJPhysiolEndocrinolMetab,2008,295(3):E637-647.