高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素对体外培养视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响

高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素对体外培养视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响

李芳宋鄂董宇陈雪艺

李芳1宋鄂2董宇2陈雪艺1（1新疆医科大学第一附属医院眼科830000；2吉林大学第一附属医院眼科130021）

【中图分类号】R587.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2011）39-0019-03

【摘要】目的探讨高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素对体外培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的影响。方法采用荧光探针技术，应用激光共聚焦显微镜动态、定量测定细胞外高钙、钙拮抗剂条件下，正常、高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖＋高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i的变化。结果高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素、高浓度葡萄糖＋高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i明显升高，在细胞外高钙条件下各组[Ca2+]i均降低，在细胞外钙拮抗剂条件下各组[Ca2+]i均再次下降。结论高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素均能使视网膜Müller细胞胞内[Ca2+]i明显升高，而钙拮抗剂通过干扰细胞外钙离子进入细胞来降低[Ca2+]i。

【关键词】葡萄糖胰岛素钙离子视网膜Müller细胞糖尿病视网膜病变

糖尿病视网膜病(diabeticretinopathy，DR)是糖尿病常见和严重的微血管并发症之一，目前，胰岛素和口服降糖药是治疗糖尿病的主要途径，研究证明DR的神经元的功能丧失和死亡归因于Müller细胞的反应性变化[1]。视网膜Müller细胞是一种特化的神经胶质细胞，贯穿视网膜全层，包裹所有的视网膜神经元，维持视网膜的结构和功能，参与视网膜的多种病理生理过程[2]。钙离子广泛存在于细胞内、外液,[Ca2+]i是调节细胞生长和信号传递等生理过程的重要因素，研究发现视网膜内钙离子含量及糖尿病病程高度正相关[3]。因此阐明高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素条件下视网膜Müller细胞[Ca2+]i的变化及其在DR的发病中的作用，将有可能为防治DR提供新的思路。

1材料与方法

材料

1.实验动物：健康成年大耳白兔由吉林大学实验动物中心提供，雌雄不限。

2.主要试剂：DMEM培养液，标准胎牛血清（均为美国Gibco公司产品）；fluo-3荧光染色剂（Biotium公司产品），EDTA（上海生工产品）；维拉帕米（上海九福产品）。

3.主要仪器设备：CO2恒温培养箱（日本Sanyo公司产品）；激光共聚焦显微镜FV500（日本Olympus公司产品）；倒置生物显微镜（日本Olympus公司产品）；KR-20000T台式高速离心机（美国Sartouris公司产品）。

方法

1.Müller细胞的培养及鉴定[4]：采用组织块悬浮法培养视网膜Müller细胞，3%戊巴比妥钠(1ml/kg体重)，沿兔耳缘静脉注入，待麻醉有效后，无菌操作取出眼球，D-Hank’s液冲洗3遍，沿锯齿缘后约1mm处环行剖开眼球，去除晶状体和玻璃体，留后半眼球壁置于DMEM培养液中剥离视网膜，轻轻洗掉粘着的色素上皮细胞，将视网膜置于体视显微镜下，去除富含血管及髓放线的部分，将视网膜撕碎成约1mm×1mm小片组织。吸取组织块置于培养瓶中，加足量含15%标准胎牛血清的DMEM培养液，置于5%CO2孵箱内，37℃下保存（图1，2）。约7天后，组织块贴壁并长出数个细胞，悬浮组织块周边发亮（图3），此时用吸管吹打贴壁的组织块，吸入离心管中离心800r/min×5min，弃上清液，加入培养液重悬沉淀，再移入另一培养瓶中培养，约2周后，细胞从组织块周边爬出并达到80%以上融合，此时可进行消化传代。传代方法如下：将培养瓶内培养液吸出，加入0.25%胰蛋白酶37℃下消化，当细胞周边开始收缩时停止消化，弃胰蛋白酶，用含血清的DMEM培养液轻轻冲洗2遍，加入无血清的DMEM培养液，用吸管吹打，吸入离心管中离心800r/min×5min，弃上清液，加入培养液重悬沉淀，1:2～1:3移入培养瓶中培养。HE染色、GFAP免疫组织化学法（图4-7）及透射电镜法[5]（图8）鉴定视网膜Müller细胞。

(箭头所示)（2500×）

2.实验分组：第2代培养细胞（P2）用于实验。将细胞（细胞计数：7×105/ml）传代于24孔板中，使细胞均匀分布于各孔，至细胞达到80%融合时，弃掉DMEM培养液，换条件培养液，共分为4组：（1）N－正常对照组：DMEM培养液，培养1天、3天、5天（1N、3N、5N）；（2）H－高糖组：50mmol/L高浓度葡萄糖DMEM培养液，培养1天、3天、5天（1H、3H、5H）；（3）I－高胰岛素组：4U/L高浓度胰岛素DMEM培养液，培养1天、3天、5天（1I、3I、5I）；（4）HI－高糖高胰岛素组：50mmol/L高浓度葡萄糖＋4U/L高浓度胰岛素DMEM培养液，培养1天、3天、5天（1HI、3HI、5HI）。

3.[Ca2+]i检测：（1）24孔板中融合生长的P2代Muller细胞，PBS洗3min×1，加入PBS180μl及fluo-3荧光染色剂20μl，5%CO2恒温培养箱37℃下孵育40min；（2）吸出孔中液体，PBS洗3min×3，加入PBS100μl，激光共聚焦显微镜530nm激发，动态检测，50秒时加入20mmol/LCaCl2溶液40μl，220秒时加入维拉帕米40μl，1帧/2秒，记录400秒，共200帧。

4.结果判定：细胞内有钙离子表达时表现为绿色荧光，绿色荧光强弱反映[Ca2+]i高低及其变化，荧光强度通过激光共聚焦显微镜计算峰值，每孔随机动态检测10个细胞，实验重复3次，结果以X-±S表示。

5.统计学分析：所有检测数据应用SPSS13.0软件处理，以P<0.05作为差异有统计学意义。

2结果

fluo-3荧光染色显示，高浓度葡萄糖、高浓度胰岛素培养的视网膜Müller细胞胞内均可见钙离子表达，表现为绿色荧光，其强弱反映胞内[Ca2+]i高低（表1）。

1.高糖组、高胰岛素组、高糖高胰岛素组培养的视网膜Müller细胞与正常对照组相比胞内[Ca2+]i均升高（P<0.01）。1天、3天时高糖高胰岛素组细胞较高糖组细胞[Ca2+]i高，但5天时低于高糖组细胞。（图1、2）

2.细胞外环境加入钙液后，正常对照组细胞胞内[Ca2+]i升高（P<0.01），高糖组、高胰岛素组、高糖高胰岛素组细胞胞内[Ca2+]i均明显降低（P<0.01）但仍高于正常对照组。1天、3天时高糖高胰岛素组细胞较高糖组细胞[Ca2+]i高，但5天时低于高糖组细胞。（图3）

3.细胞外环境加入维拉帕米后各组细胞[Ca2+]i均降低（P<0.01），高糖组、高胰岛素组、高糖高胰岛素组细胞[Ca2+]i仍高于正常对照组。1天、3天时高糖高胰岛素组细胞较高糖组细胞[Ca2+]i高，但5天时低于高糖组细胞。（图4）

表1不同条件不同时间培养的Müller细胞胞内[Ca2+]i表达结果

注：°与前一状态比P<0.05，°°与前一状态比P<0.01，*与相应时间正常组相比P<0.05，**与相应时间正常组相比P<0.01，△高糖高胰岛素组与相应时间高糖组相比P<0.05，△△高糖高胰岛素组与相应时间高糖组相比P<0.01。

3讨论

高血糖是促进DR发展的重要危险因素之一，DR的发生与血糖的高低密切相关。胰岛素治疗是一种外源性的，非生理性的治疗，在应用早期可能促进DR进展，我们的前期研究也证实：高浓度胰岛素可能通过增强Müller细胞VEGF蛋白的表达加速DR的新生血管形成[6]。钙离子广泛存在于细胞内、外液，具有重要的生理功能，[Ca2+]i是调节细胞生长和信号传递等生理过程的重要因素，它是细胞生理功能的重要物质基础，也是多种受体激动后信号传递过程的中心环节，与缺血有关的视网膜变性可能是细胞内钙积累的结果，即所谓“钙超载”状态，研究发现糖尿病大鼠视网膜在发病4周后可测到细胞凋亡，同时伴有视网膜组织内钙离子浓度的增加，并发现视网膜内钙离子含量及糖尿病病程高度正相关[3]。

我们的研究结果显示，高糖组、高胰岛素组、高糖高胰岛素组培养的视网膜Müller细胞较正常对照组细胞胞内[Ca2+]i升高，究其原因，可能是高浓度葡萄糖和高浓度胰岛素促进细胞膜上钙通道的开放，增加了钙内流。因为研究发现Müller细胞可以分泌VEGF、bFGF、PEDF等细胞生长因子[7，8]，VEGF可以通过激活内皮细胞上的VEGF受体而激活钙离子通道，引起细胞内钙离子浓度的升高[9]，而我们在前期实验中已经证明高糖、高胰岛素、高糖高胰岛素都可以导致Müller细胞VEGF表达增加，推测很可能是在高糖、高胰岛素的影响下，Müller细胞VEGF表达增加，激活了Müller细胞钙离子通道，使胞外钙离子进入增加，并影响细胞内钙库的释放，导致细胞内[Ca2+]i升高；另外，本实验还证实，尽管高糖高胰岛素培养的Müller细胞较高糖培养的Müller细胞胞内[Ca2+]i升高，但只是1天和3天时为高，5天开始是降低的，结合胰岛素临床治疗经验，考虑可能是应用胰岛素一定时间后，视网膜Müller细胞对其作用出现了适应反应，并逐渐平稳，这从另一角度说明了胰岛素是DR治疗中的双刃剑，它早期可能通过增强视网膜Müller细胞VEGF蛋白的表达以及增加Müller细胞胞内[Ca2+]i促进DR进展，但长期应用有可能通过降低“钙超载”达到一定的治疗目的。

关于细胞胞内[Ca2+]i升高的机制比较复杂，目前认为主要有2条途径，一个是细胞外钙的进入，另一个是细胞内内质网钙库的钙释放。本组实验在Müller细胞外环境中加入钙液后，正常组细胞胞内钙离子浓度升高，且在加入钙通道拮抗剂维拉帕米后细胞胞内[Ca2+]i明显降低，我们推测可能是在胞外钙离子浓度升高情况下，细胞钙离子通道被激活，胞外钙流入胞内，引起胞内钙离子浓度的升高。但与正常组不同，高糖组、高胰岛素组、高糖高胰岛素组细胞胞内钙离子浓度明显降低但仍较正常组为高，我们推测在胞外钙离子浓度升高的情况下，持续升高的胞浆游离Ca2+可能激活细胞膜上的钙泵而排出部分Ca2+，以维持细胞浆游离Ca2+的恒定，还有可能是高糖、高胰岛素直接影响了钙离子通道，不仅使胞外钙离子进入减少，而且影响细胞内钙库的释放，导致细胞内钙离子浓度降低，但是这种作用是有限的，所以胞内[Ca2+]i仍然高于正常组。

钙通道拮抗剂是一类阻滞钙离子从细胞外液经电压依赖性钙通道流入细胞内的药物，维拉帕米是一种可靠有效的钙通道拮抗剂，本实验中细胞外环境中加入维拉帕米后各组细胞胞内[Ca2+]i均明显降低，这说明Ca2+主要是通过电压依赖性钙通道进入细胞内的。钙通道拮抗剂包括多种化学结构不同的药物，能干扰细胞内钙离子释放及细胞外钙离子进入细胞内，但只有L型Ca2+通道对现有的钙拮抗剂较敏感，而T和N型则多不敏感，所以本实验结果证明在视网膜Müller细胞中存在L型钙离子通道，这与Uchihori的研究结果相似，且其研究还发现，在人多种眼部疾病中L型Ca2+通道在培养的Müller细胞中参与细胞的增殖活动的调节[11]，这意味着钙通道拮抗剂在视网膜病变的治疗中有广阔的应用前景，这也是是有关钙通道及钙离子方面研究的最终目的。

参考文献

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