华南远志DNA的限制性酶切分析

华南远志DNA的限制性酶切分析

刘小刚1钟远强2（1,北京理工大学珠海学院化工与材料学院

摘要：采用DNAEcoRI/MseI双酶切的方法，对CTAB法、高盐低pH法和SDS法对华南远志干叶样品DNA进行了分析。结果表明：CTAB法所提取的DNA样品，可被酶充分水解。

关键词：华南远志；DNA；双酶切

Abstract:Thetota1DNAwasextractedfromthedry1eafofPolygalaglomerataLourtreatedwithandwithoutPVPandTNEbufferbymeansofCTAB，highsalt，lowpHandSDS.TheDNAsampleswereanalysisedbyrestrictionwithEcoRIandMseIandagarosegele1ectrophocesis.TheresultsshowedthattheDNAofCTABwasdigestedbyEcoRIandMseI.

Keywords:PolygalaglomerataLour；totalDNA；restrictionendonuclease

华南远志为一年生直立草本，为远志科植物华南远志的干燥全草[1]。全草入药，有活血解毒，平肺，消积效用，主治慢性肝炎，神经衰弱等。其药理作用也受到华南远志种类、产地、采收时间、加工方法等因素影响，因而会出现药材质量不稳的现象。摸索方便、快捷、高质量DNA提取方法，从分子水平上研究其物种多样性以及不同居群的关系，将给药材的鉴别提供新的方法与思路。

由于植物所含次生代谢产物不同，不同的方法所获得DNA的质量也不尽相同。为深入研究华南远志物种多样性以及不同居群的关系，需采用多种的分子标记技术，这些方法对DNA质量的要求也存在差异。因此，对样品DNA进行双酶切分析，有助于选择合适分子标记技术。

1材料与方法

1.1试验材料

华南远志叶片(硅胶干燥)。

聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，EcoRI/MseI，上海生工；十六烷基三乙基溴化铵（CTAB），Tris，乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，十二烷基磺酸(SDS)，无水乙醇，异丙醇等均为国产分析纯试剂。

1.2方法

1.2.1华南远志样品DNA的提取

称取干叶0.03g，研磨成细粉状，移入2ml的离心管中，分别采用改良的CTAB[2]法、SDS法和高盐低pH值法[3]提取总DNA[4]。

1.2.2华南远志样品的DNAEcoRI/MseI双酶切检测

20μL的酶切体系中含有4μL约为50ng/μL样品DNA，EcoRI和MseI分别为4U和4U。然后，依次在37℃孵育3h，65℃孵育3h，80℃处理20min，琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.3琼脂糖凝胶电泳

DNA提取和酶切样品分别利用1.0%和1.4%的琼脂糖凝胶电泳，将5μLDNA样品加入5μL二次蒸馏水，再加2μL溴酚蓝上样缓冲液混合上样，80V恒压电泳1小时，EB染色，BIOIMAGINGSYSTEM凝胶成像系统照相分析。

2结果

2.1华南远志干叶DNA的提取

三种方法均能提出样品DNA，其中CTAB法DNA量较大（图1），而SDS法和高盐低pH值法DNA条带清晰，但样品颜色较深，且DNA量较少。

2．2华南远志干叶DNA的双酶切检测

三种样品DNA经EcoRI/MseI双酶切（图2）。结果表明：其中CTAB法酶切充分，呈均一的弥散状,而SDS法和高盐低pH值法所获得的样品酶切不充分。

讨论

采用改良的CTAB法、SDS法和高盐低pH值法能提取到高质量的华南远志DNA样品，但其质量存在明显的差异,用EcoRI和MseI对样品DNA进行双酶切检测,结果表明：CTAB法样品DNA条带明显，拖尾较轻，酶切完全，产物均呈现弥散状，DNA纯度较高。

综上所述：PVP和TNE预处理，可有效去除华南远志干叶中多种次生代谢物质，经CTAB法提取的DNA条带清晰，粘度小，无颜色变化，可以用于RAPD和AFLP分析。为深入进行华南远志种植资源、遗传式样等分子生物学方面的研究奠定基础。

参考文献

[1]赵云生，严铸云，李占林.远志属药用植物有效物质群结构特点及其生理活性[J].中医药学刊，2005，23（8）：1420-1423.

[2]顾红雅，翟礼嘉，明小天等.植物基因和分子操作[M].北京：北京大学出版社，1995

[3]邹喻苹，汪小荃，雷一丁等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定[J]．植物学报，1994，36（7）：528-533.

[4]刘小刚，钟远强.华南远志DNA提取方法的比较研究[J].今日科苑，2009，3（6）.