摘要:采用DNAEcoRI/MseI双酶切的方法,对CTAB法、高盐低pH法和SDS法对华南远志干叶样品DNA进行了分析。结果表明:CTAB法所提取的DNA样品,可被酶充分水解。
关键词:华南远志;DNA;双酶切
Abstract:Thetota1DNAwasextractedfromthedry1eafofPolygalaglomerataLourtreatedwithandwithoutPVPandTNEbufferbymeansofCTAB,highsalt,lowpHandSDS.TheDNAsampleswereanalysisedbyrestrictionwithEcoRIandMseIandagarosegele1ectrophocesis.TheresultsshowedthattheDNAofCTABwasdigestedbyEcoRIandMseI.
Keywords:PolygalaglomerataLour;totalDNA;restrictionendonuclease
华南远志为一年生直立草本,为远志科植物华南远志的干燥全草[1]。全草入药,有活血解毒,平肺,消积效用,主治慢性肝炎,神经衰弱等。其药理作用也受到华南远志种类、产地、采收时间、加工方法等因素影响,因而会出现药材质量不稳的现象。摸索方便、快捷、高质量DNA提取方法,从分子水平上研究其物种多样性以及不同居群的关系,将给药材的鉴别提供新的方法与思路。
由于植物所含次生代谢产物不同,不同的方法所获得DNA的质量也不尽相同。为深入研究华南远志物种多样性以及不同居群的关系,需采用多种的分子标记技术,这些方法对DNA质量的要求也存在差异。因此,对样品DNA进行双酶切分析,有助于选择合适分子标记技术。
1材料与方法
1.1试验材料
华南远志叶片(硅胶干燥)。
聚乙烯吡咯烷酮(PVP),EcoRI/MseI,上海生工;十六烷基三乙基溴化铵(CTAB),Tris,乙二胺四乙酸二钠(EDTA),十二烷基磺酸(SDS),无水乙醇,异丙醇等均为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1华南远志样品DNA的提取
称取干叶0.03g,研磨成细粉状,移入2ml的离心管中,分别采用改良的CTAB[2]法、SDS法和高盐低pH值法[3]提取总DNA[4]。
1.2.2华南远志样品的DNAEcoRI/MseI双酶切检测
20μL的酶切体系中含有4μL约为50ng/μL样品DNA,EcoRI和MseI分别为4U和4U。然后,依次在37℃孵育3h,65℃孵育3h,80℃处理20min,琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.3琼脂糖凝胶电泳
DNA提取和酶切样品分别利用1.0%和1.4%的琼脂糖凝胶电泳,将5μLDNA样品加入5μL二次蒸馏水,再加2μL溴酚蓝上样缓冲液混合上样,80V恒压电泳1小时,EB染色,BIOIMAGINGSYSTEM凝胶成像系统照相分析。
2结果
2.1华南远志干叶DNA的提取
三种方法均能提出样品DNA,其中CTAB法DNA量较大(图1),而SDS法和高盐低pH值法DNA条带清晰,但样品颜色较深,且DNA量较少。
2.2华南远志干叶DNA的双酶切检测
三种样品DNA经EcoRI/MseI双酶切(图2)。结果表明:其中CTAB法酶切充分,呈均一的弥散状,而SDS法和高盐低pH值法所获得的样品酶切不充分。
讨论
采用改良的CTAB法、SDS法和高盐低pH值法能提取到高质量的华南远志DNA样品,但其质量存在明显的差异,用EcoRI和MseI对样品DNA进行双酶切检测,结果表明:CTAB法样品DNA条带明显,拖尾较轻,酶切完全,产物均呈现弥散状,DNA纯度较高。
综上所述:PVP和TNE预处理,可有效去除华南远志干叶中多种次生代谢物质,经CTAB法提取的DNA条带清晰,粘度小,无颜色变化,可以用于RAPD和AFLP分析。为深入进行华南远志种植资源、遗传式样等分子生物学方面的研究奠定基础。
参考文献
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[2]顾红雅,翟礼嘉,明小天等.植物基因和分子操作[M].北京:北京大学出版社,1995
[3]邹喻苹,汪小荃,雷一丁等.几种濒危植物及其近缘类群总DNA的提取与鉴定[J].植物学报,1994,36(7):528-533.
[4]刘小刚,钟远强.华南远志DNA提取方法的比较研究[J].今日科苑,2009,3(6).