星形胶质细胞连接蛋白43及其半通道在缺血再灌注(IR)损伤中的作用分析

星形胶质细胞连接蛋白43及其半通道在缺血再灌注(IR)损伤中的作用分析

陈伟伟张中伟

昆明学院医学院陈伟伟昆明医科大学第一附属医院张中伟

关键词：星形胶质细胞；连接蛋白43；半通道；缺血再灌注(IR)损伤

缝隙连接（GJs）是相邻细胞之间的跨膜通道，相邻细胞膜上的两个半通道相互锚定就组成了GJs，其在细胞凋亡信号的传导以及信息交流等发面发挥着非常重要的作用。缝隙连接蛋白（Cx）是两个通道的结构蛋白，人体中含量最为丰富的是Cx43，并且大鼠的神经细胞中也存在Cx43。半通道在内质网合成后会被锚定于细胞膜上，在形成GJs以前，其会以一种封闭的状态而短暂的存在于细胞膜中。有研究人员发现，星形胶质细胞与其他类型细胞的半通道可能开放与其对应的各种触发物[1]。触发半通道开放以及促使持续释放的胞内信号比较广泛，大部分都与细胞凋亡的条件和信号有着密切的联系。其中包括Cx43。本次研究就对星形胶质细胞连接蛋白43（Cx43）及其半通道在缺血再灌注(IR)损伤中的作用进行了详细的研究。

1资料与方法

1.1一般资料

本次研究选取36只大鼠，体质量（305±45）g，均来自某实验中心。动物组织的使用均依照《赫尔基宣言》，并且均在设定好的的条件中生活1周，温度为（23±1）℃，湿度为（60±10）%，12h的光/暗循环，所有大鼠均能够自由获取到食物和水。将其随机分成观察组和对照组，各18只。两组大鼠的一般资料没有明显差异（P＞0.05），有可比性。

1.2方法

模型建立。对照组，与观察组除了要夹紧双侧颈动脉外其余均相同。

观察组大鼠模型的建立，采用10%的水合氯醛对本组大鼠进行麻醉，将其颈总动脉夹紧1.5h引起脑缺血，对其进行再灌注，手术中将大鼠的体温维持在36.5～37.5℃，再灌注杀死大鼠后经主动脉灌注生理盐水，采用浓度为4%的250ml的多聚甲醛（Ph值为7.4）进行固定。

免疫组化法。大鼠脑室管膜下区组织经脱水冷却后做成冰冻组织切片，用4%的多聚甲醛固定，再用聚乙二醇辛基苯基醚进行通透。加入Cx43（1:2000），HC1（1:200），洗涤后再进行孵育，固定切片后，取同种血清做阴性进行对照，获得显微镜图像，并对Casp3染色的细胞比例进行分析。

脑组织的免疫印迹分析。对SVZ区域的脑组织细胞经裂解、离心、电泳、转膜、孵育等过程后，用Tublin作对照，将对照结果采用ScanJet3c平床扫描仪进行扫描，对吸光度进行分析。Western印迹法对两组大鼠星形胶质细胞Cx43、半通道抗体1（HC1）进行检测。

1.3观察指标

观察并比较两组大鼠星形胶质细胞Cx43、HC1的表达。

1.4统计学分析

采用SPSS19.0软件对本次研究所得到的数据进行处理，计量资料用均数±标准差（）表示，用t检验，计数资料用百分比（%）表示，用χ2检验，当P＜0.05时，表示差异具有统计学意义。

2结果

大鼠星形胶质细胞中HC1的表达明显少于Cx43的表达。观察组大鼠脑组织中的Cx43、HC1表达均高于对照组，差异明显（P＜0.05）有统计学意义。详见下图1：

图1A为观察组损伤后大鼠脑神经胶质细胞中Cx43+GFAP表达的双重免疫染色；B为观察组损伤后大鼠脑神经胶质细胞中HC1+GFAP表达的双重免疫染色。（箭头代表Cx43/HC1阳性着色，绿色代表Cx43和HC1，红色代表GFAP，蓝色代表Bar=50μm）

3讨论

在缺血再灌注的情况下，细胞会以不同的方式出现凋亡，其均会导致细胞膜破裂。目前，研究人员均认为细胞凋亡和细胞坏死属于连续性的瀑布化反应，细胞可在两者之间进行转换，大多人认为死亡主要取决于外部条件。但是也有研究人员认为，缺血再灌注引起的继发性细胞凋亡还包括细胞膜的破裂，其尤其会出现在血流恢复的最初几分钟，但是如果在没有缺血的情况下，几个小时后凋亡细胞的数量才会明显增多。

星形胶质细胞与脑毛细血管之间存在着极其复杂的联系，其会紧紧围绕着脑微血管内细胞，最终会存有大量的GJs和Cx43。由于缺血再灌注时，细胞膜上的Cx43可能会出现重新分布，，进而会形成更大的GJs斑，这也在一定程度上加强了终足的同步功能，当出现缺血损伤是，尤其在早期会对血-脑屏障功能进行保护。但是随着损伤程度的加重，终足与星形胶质细胞的同步，加重了水肿的严重程度，进而对导致血脑屏障的外层防线造成了损伤。

Cx43可能会随着Casp3的升高以及细胞活性的下降能够对再灌注早期星形胶质细胞凋亡的进程进行调整，Casp3的降低以及细胞活性的升高也在很大程度上减少了细胞的凋亡，进而增强了细胞的生存能力，Cx43与其一致，因此更加证明Cx43能够促进星形胶质细胞的存活[2]。半通道像GJs一样也参与了细胞凋亡的复杂级联反应，因此，在细胞凋亡信号的传导中也扮演着极其重要的角色。由于其能够释放出一些作用于周围细胞的物质，能够通过GJs向周围细胞进行传播，另外，细胞半通道开放能够使而本身离子失衡，进而引起细胞凋亡[3]。

本次研究结果也显示，大鼠星形胶质细胞中HC1的表达明显少于Cx43的表达。观察组大鼠脑组织中的Cx43、HC1表达均高于对照组，差异明显（P＜0.05），有统计学意义。这与李书玮[4]的研究结果是一致的。

综上所述，Cx43及HC1在星形胶质细胞凋亡的过程中起到了积极的促进性作用，这极有可能是IR损伤发生以及发展的机制之一。

参考文献：

[1]张建,陈丽芬,邹海艳等.脑缺血后星形胶质细胞连接蛋白43表达及功能改变的研究进展[J].中国脑血管病杂志,2018,15(11):607-610.

[2]秦川,渠文生.脑白质低灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接蛋白43的表达变化[J].中国实用神经疾病杂志,2016,19(16):44-46.

[3]牛非,胡金凤,苑玉和等.星形胶质细胞在脑缺血中的变化和作用[J].中国药理学通报,2011,27(10):1342-1345.

[4]李书玮,马爱华,王学禹等.星形胶质细胞连接蛋白43及其半通道在脑缺血再灌注损伤中的作用[J].临床神经病学杂志,2016,29(02):128-132.

[5]缝隙连接蛋白-43半通道在大鼠脑缺血再灌注损伤中对神经元损伤的影响[J].中华医学杂志,2015,95(3):221-225.

[6]余琼,俞彰,梁伟民.七氟醚预处理对脑缺血再灌注损伤后星形胶质细胞缝隙连接的影响[J].中国临床神经科学,2016,24(3):254-259.

[7]丘敏,曾维勇,刘微,等.补阳还五汤对脑缺血再灌注后星形胶质细胞connexin43影响[J].辽宁中医药大学学报,2015，17(5):36-38.

[8]郭建超,苏宁,刘微,等.补阳还五汤对脑缺血再灌注后星形胶质细胞connexin43影响机制的研究[J].辽宁中医杂志,2017,44(11):2418-2420+2466.

[9]王占奎,刘坤,肖震心,等.针刺调控大鼠脑缺血再灌注损伤Cx43半通道的机制研究[J].天津中医药,2015,32(4):215-219.

[10]郭姝丽,王占奎,郭家奎.调神通络针刺法对缺血再灌注大鼠海马区神经元形态及Cx43半通道影响的实验研究[J].湖南中医杂志,2017,33(9):157-159.

[11]M型钾离子通道开放剂对脑梗死再灌注损伤的保护作用[J].西安交通大学学报(医学版),2016,37(5):636-640.

[12]徐鑫淼,金勇君,郭伟,等.胍丁胺对脑缺血再灌注大鼠血脑屏障通透性水通道蛋白4和基质金属蛋白酶9的影响[J].中华行为医学与脑科学杂志,2015,24(3):204-207.

document.getElementById('cnt-ad').style.display='none';