吲达帕胺缓释片的人体药动学和生物等效性

吲达帕胺缓释片的人体药动学和生物等效性

刘茜李桃霞赵辉丁雅楠

刘茜李桃霞赵辉丁雅楠（沈阳药科大学药物分析实验室辽宁沈阳110016）

【摘要】目的研究吲达帕胺缓释片在健康男性志愿者体内的药代动力学和生物等效性。方法测定18名健康男性志愿者分别单剂量和多剂量口服含吲达帕胺1.5mg的受试制剂和参比制剂后全血中的吲达帕胺浓度。结果单剂量给药时受试制剂和参比制剂的主要药动学参数为：Tmax(10.33±1.46)h和(10.83±0.62)h，Cmax(72.0±13.8)ng•ml-1和(73.7±13.2)ng•ml-1，AUC0-t(1367.9±443.8)ng•h•ml-1和(1335.7±330.8)ng•h•ml-1，以AUC0-t计算相对生物利用度为(102.1±19.4)％,受试制剂中吲达帕胺AUC0-t的90%置信区间分别为参比制剂相应参数（92.4～108.9）%。多剂量给药时受试制剂和参比制剂的主要药动学参数为：Tmax(10.56±1.10)h和(10.72±0.67)h，Cssmax(67.5±11.8)ng•ml-1和(71.8±9.0)ng•ml-1，Cssmin分别为(23.2±3.9)ng•mL-1和(23.9±3.7)ng•mL-1，Cav分别为(37.8±4.6)ng•mL-1和(37.6±4.7)ng•mL-1，AUCss(908.4±110.5)ng•h•ml-1和(902.7±111.8)ng•h•ml-1，重复给药血药浓度波动程度DFss分别为1.17±0.25和1.29±0.28。以AUCss计算，相对生物利用度为(101.7±14.3)％，受试制剂中吲达帕胺AUCss的90%置信区间为参比制剂相应参数的（95.0～106.7）%。结论两种吲达帕胺制剂在体内生物等效。

【关键词】吲达帕胺缓释片液相色谱-紫外检测法药动学生物等效性

【中图分类号】96【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）10-0101-03

PharmacokineticsandBioequivalenceofindapamideSustained-releaseTabletinHealthyVolunteers

LIUQian*,LITao-xia,ZHAOHui,DingYanan(ShenyangPharmaceuticalUniversity,Shenyang110016,China)

【ABSTRACT】Objective:TodevelopaHPLC-UVmethodforthedeterminationofindapamideinhumanwholeblood,andstudytherelativebioavailabilityandbioequi-valenceofsustained-releasetablets.Methods:Asingleormultipleoraldoseof1.5mgindapamidereferencepreparationandtestpreparationweregivento18healthyv-olunteersinarandomizedcrossed-overdesign.TheconcentrationofindapamideinwholebloodwasdeterminedbyHPLC-UV.Result:Themainpharmacokineticpar-ametersoftestandreferencepreparationsafterasingledosewere:Tmax(10.33±1.46)and(10.83±0.62)h,Cmax(72.0±13.8)and(73.7±13.2)ng•ml-1,AUC0-t(1367.9±443.8)and(1335.7±330.8)ng•h•ml-1,respectively.Therelativebioavailabilitywas(102.1±19.4)％.Themainpharmacokineticparametersoftestandreferencepreparationsaftermultipledoseswere:Tmax(10.56±1.10)and(10.72±0.67)h,Cssmax(67.5±11.8)and(71.8±9.0)ng•ml-1,Cssminwere（23.2±3.9）and（23.9±3.7）ng•mL-1，were（37.8±4.6）and（37.6±4.7）ng•mL-1，AUCss(908.4±110.5)and(902.7±111.8)ng•h•ml-1,DFsswere（1.17±0.25）and（1.29±0.28）,respectively.Therelativebioavailabilitywas(101.7±14.3)％.Conclusion:TherewerenosignificantdifferencesinthemainparametersoftwopreparationsasanalyzedbyANOVAandtwo-andone-sidedt-test.Thetestpreparationwasbioequivalenttothereferencepreparation.

【KeyWords】indapamidesustained-releasetabletsHPLC-UVpharmacokineticsbioequivalence

吲达帕胺(indapamide)为磺胺类利尿剂，临床上主要用于治疗高血压。降压作用未明，因降压作用出现的剂量远小于利尿作用的剂量，可能的机制包括以下几个方面：调节血管平滑肌钙内流，刺激前列腺素PGE2和PGI2的合成，减低血管对血管加压胺的超敏感性，从而抑制血管收缩。吲达帕胺血浆浓度的测定已有质谱法、紫外法[1-5]等报道。本研究建立了灵敏、快速的HPLC-UV法测定人全血中的吲达帕胺，考察了18名健康男性志愿者单剂量和多剂量口服两种制剂的药动学，并评价这两种制剂的人体生物等效性，为其临床应用提供参考。

1、实验部分

1.1仪器和试药

1.1.1药品与试剂受试制剂：吲达帕胺缓释片（规格：1.5mg；批号20050109），北京毫克达医药科技发展有限公司；参比制剂：吲达帕胺缓释片（规格：1.5mg；批号：20050109），法国施维雅药厂施维雅（天津）制药有限公司。对照品：吲达帕胺对照品（含量：99.7%）由黄山中皇制药有限公司提供；内标物：格列吡嗪对照品（含量：99.8%）由黄山中皇制药有限公司提供。试剂：乙腈、甲醇为色谱纯，乙醚、二氯甲烷、氢氧化钠、磷酸二氢钾为分析纯，水为纯净水。空白全血由沈阳军区总医院提供。

1.1.2仪器LC-10ATVP型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；L-7420型紫外可见检测器（日本日立公司）；N3000色谱工作站（浙江大学）；TGL-16G型离心沉淀机（上海安亭科学仪器厂）；XW-80A涡旋混合器（上海手术器械厂）；DAS统计计算软件（中国药理学会数学药理专业委员会编制）。

1.2受试对象实验方案经辽宁省人民医院伦理委员会批准。选择18名健康男性志愿受试者，年龄为(22.80±1.0)岁，身高(174.7±6.0)cm，体重(72.7±8.7)kg。于试验前在临床研究医院接受全面体检，经对血常规、肝、肾功能和心电图检查，结果均属正常。受试者无继往病史和药物过敏史，精神状态良好，不吸烟，不嗜酒，试验前两周至实验期间禁烟、酒和禁服其他任何药物。试验前均签署知情同意书。

1.3实验方案

1.3.1单剂量给药实验：受试者服药前一天晚上食用清淡食品，受试前禁食10小时给药4h后统一进食。受试当天早晨空腹服药，定时记录心电图，随机分成两组，采用双周期交叉试验。受试者早晨空腹口服吲达帕胺缓释片1片（1.5mg，受试制剂）或吲达帕胺缓释片1片（1.5mg，参比制剂）。服药以200mL温开水送服（顿服），分别于服药前(0h)和服药后1、2、4、6、8、10、11、12、24、36、48、60h采肘静脉血5mL，所采全血血样置含肝素抗凝剂离心试管中，保存于－20℃冰箱待测。

1.3.2多剂量给药试验：于单剂量试验后开始服药，连续给药7天，每日早上服吲达帕胺缓释片1片（1.5mg，受试制剂）或吲达帕胺缓释片1片（1.5mg，参比制剂）。服药以200mL温开水送服（顿服），第5-7天在早上服药前取静脉血5mL，第8天早晨服药前(0h)和服药后1、2、4、6、8、10、11、12、16、20、24h分别采静脉血5mL，所采全血血样置含肝素抗凝剂离心试管中，保存于－20℃冰箱中待测。间隔两周,交叉服用受试制剂与参比制剂，第二次采血程序与第一次相同。

1.4全血样品处理于置塞离心管中分别加入全血500μL，加内标溶液（格列吡嗪5.0μg•mL-1）50μL，氢氧化钠溶液50μL（0.1mol•mL-1），乙醚∶二氯甲烷（3∶2）3mL，涡旋混合30min，离心（10000r•min-1）3min，取上层有机相，氮气流下（40℃）吹干，残渣加甲醇50μL溶解，取20μL进行HPLC分析。

1.5血浆样品分析测定

1.5.1色谱条件色谱柱；DiamonsiLODSC18柱（200mm×4.6mm，5μm）；流动相：磷酸缓冲液（pH6.5）∶乙腈（55∶43）；流速：1.0mL•min-1；柱温：35℃；检测波长：242nm；进样量：20μL。

1.5.2溶液的配制

吲达帕胺储备液的配制精密称取吲达帕胺对照品10.0mg，加甲醇溶解并稀释得到浓度为50.0,100.0,200.0,500.0,1000.0,1600.0,2000.0ng•mL-1的吲达帕胺标准系列溶液。

内标溶液的配制精密称取格列吡嗪对照品10.0mg，用甲醇溶解并稀释得到浓度为5.0μg•mL-1内标溶液。

1.5.3方法专属性分别取6名受试者空白全血500μL，按“全血样品的分析方法”依法操作（不加内标溶液），进样20μL，得色谱图，如图1-a；将一定浓度标准溶液和内标溶液加入空白全血，依同法操作，得色谱图，如图1-b；取健康受试者给药后收集的全血样品，依同法操作，得色谱图，如图1-c。结果表明，空白全血中内源性物质及吲达帕胺的代谢物不干扰吲达帕胺的测定。

(A)(B)(C)

Peaks1：indapamide；peaks2;Internalstandard(glipizide)

Figure1HPLCchromatogramsofblankwholebloodsample.(A),blankwholebloodsamplespikedwithindapamideandtheirIS.(B)andwholebloodsamplefromahealthyvolunteer.(C).

图1空白全血(A)、空白全血对照（B）和样品（C）的色谱图

1.5.4标准曲线与定量下限取人空白全血500μL，各加入吲达帕胺标准系列溶液50μL，制成相当于吲达帕胺浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0ng•mL-1的模拟全血样品，按“全血样品处理”项下操作，进样20μL，记录色谱图。以待测物浓度为横坐标，待测物与内标物峰面积比值为纵坐标，用加权（W=1/x2）最小二乘法进行回归运算，求得直线回归方程即为标准曲线。以Y（As/Ai）为纵坐标，X(浓度)为横坐标得标准曲线方程为：Y=0.00745X+1.41(R=0.9989),根据标准曲线，吲达帕胺线性范围为5.0～200.0ng•mL-1，定量下限为5.0ng•mL-1。

1.5.5方法精密度与准确度取空白全血500μL，按“标准曲线与定量下限”项下的方法制成低、中、高三个浓度（吲达帕胺浓度分别为10.0、50.0和160.0ng•mL-1）的质量控制（QC）样品，每一浓度进行6样本分析，连续测定三天，根据当日的标准曲线，计算QC样品的测得浓度。根据QC样品测定结果计算本法的精密度与准确度。结果见表1。

1.5.6提取回收率取空白全血500L，按“方法精密度与准确度”项下方法制备低、中、高三个浓度（吲达帕胺浓度分别为10.0、50.0和160.0ng•mL-1）模拟全血样品，每一浓度进行6样本分析，并与取等量相同浓度的对照品溶液加入到空白生物基质经同样处理方法的空白提取液中制备成的溶液比较，以每一浓度两种处理方法峰面积比值计算本方法提取回收率。结果见表1。

表1人全血中吲达帕胺的提取回收率和精密度

Tab1RecoveriesandprecisionofindapamideinhumanwholebloodConcentration/ng•mL-

1.5.7稳定性本试验考察了吲达帕胺全血样品-20℃放置45d的稳定性，全血样品经历两次冷冻-解冻循环的稳定性以及全血样品经提取处理后室温放置24h的稳定性。结果测定偏差均<15%，表明全血样品在上述条件下稳定。

1.6数据处理试验所得血药浓度数据用DAS2.0软件采用非房室模型计算主要药代动力学参数，达峰时间Tmax、达峰浓度Cmax为实测值；运用梯形法计算药时曲线下面积AUC0→t；以末端相血药浓度对数值对时间进行线性回归，求得斜率Ke；AUC0→∞=AUC0→t+Ct/Ke。

1.7结果

1.7.1.单剂量给药药代动力学和生物等效性

18名受试者口服含吲达帕胺1.5mg的受试制剂和参比制剂后平均全血血药浓度-时间曲线见图2。全血吲达帕胺浓度数据经DAS2.0程序处理后得到各主要药动学参数见表2。以AUC0-t计算，吲达帕胺缓释片单次给药后的相对生物利用度平均为(102.1±19.4)%.

将主要药物动力学参数经对数转换后进行方差分析，结果显示，受试制剂和参比制剂中吲达帕胺AUC0-t、AUC0-∞和Cmax在制剂间和周期间均无显著性差异，AUC0-t和AUC0-∞在个体间有显著性差异。Tmax经非参数法检验，结果表明在制剂间和周期间均无显著性差异。进一步采用双单侧检验和（1－2α）置信区间法分析，受试制剂的AUC0-t和AUC0-∞均拒绝不等效假设，受试制剂AUC0-t的90%置信区间为参比制剂相应参数的（92.4～108.9）%，表明受试制剂与参比制剂相比在体内具有生物等效性。

1.7.2多剂量给药药代动力学和生物等效性

18名受试者多剂量口服含吲达帕胺1.5mg的受试制剂和参比制剂后平均血药浓度-时间曲线见图3。全血吲达帕胺浓度数据经DAS2.0程序处理后得到各主要药动学参数见表3。以AUC0-t计算，吲达帕胺缓释片单次给药后的相对生物利用度平均为(101.7±14.3)%。

将主要药物动力学参数经对数转换后进行方差分析，结果显示受试制剂和参比制剂中吲达帕胺AUCss、Cssmax、Cssmin、Cav和DFss值在制剂间、周期间和个体间均无显著性差异；Tmax经非参数法检验，结果表明在制剂间和周期间均无显著性差异。进一步采用双单侧检验和（1－2α）置信区间法分析，AUCss拒绝不等效假设，受试制剂AUCss的90%置信区间为参比制剂相应参数的（95.0～106.7）%，表明受试制剂与参比制剂相比在体内具有生物等效性

图2受试者单剂量口服受试制剂和参比制剂后吲达帕胺全血的平均药–时曲线（n=18）

Figure2Meanwholebloodconcentration-timecurveofindapamideafterasingleoraldoseoftwopreparations(n=18)

表2受试者单剂量口服受试制剂

和参比制剂后吲达帕胺的药动学参数(n=18)

Table2Pharmacokineticsparametersofindapamideafterasingleoraldoseoftwopreparations(n=18)

parameterTestpreparationReferencepreparation

t1/2/h13.13±2.3013.71±2.11

Ke/h-10.054±0.0110.052±0.007

Tmax/h10.33±1.4610.83±0.62

Cmax/ng•mL-172.0±13.873.7±13.2

AUC0-t/ng•h•mL-11367.9±443.81335.7±330.8

AUC0-∞/ng•h•mL-11534.0±498.51497.1±344.8

表3受试者多剂量口服受试制剂和

参比制剂后吲达帕胺的药动学参数（n=18）

Table3pharmacokineticsparameterofindapamideafter7daysrepeatedadministrationoftwopreparations(n=18)

parameterTestpreparationReferencepreparation

Tmax/h10.56±1.1010.72±0.67

Cssmax/ng•mL-167.5±11.871.8±9.0

Cssmin/ng•mL-123.2±3.923.9±3.7

Cav/ng•mL-137.8±4.637.6±4.7

AUCss/ng•h•mL-1908.4±110.5902.7±111.8

DFss1.17±0.251.29±0.28

2、讨论

由于吲达帕胺优先与红细胞结合，受试者口服吲达帕胺后，全血样中的血药浓度远远大于血浆中的血药浓度，因此本研究对全血样品进行测定。

吲达帕胺提取时，加人少量的酸可使回收率提高，但加酸会使得检测时有大量的杂质峰，因而本实验提取时未加酸。内源性物质多是酸性的，所以本实验从全血中提取吲达帕胺时加入碱即氢氧化钠溶液50μL（0.1mol•mL-1），减小内源性物质在有机相中的溶解度，有效减少了杂质峰干扰，全血样品中吲达帕胺的提取回收率＞60%，符合生物样品测定的要求。本文成功建立了人体全血中吲达帕胺浓度测定的HPLC—UV检测法。吲达帕胺线性范围为5.0～200.0ng•mL-1，定量下限为5.0ng•mL-1，适应吲达帕胺人体内药动学的研究。

参考文献

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图3受试者多剂量口服受试制剂和参比制剂后全血吲达帕胺的平均药-时曲线(n=18)

Figure3Meanwholebloodconcentration-timecurveofIndapamideafter7daysrepeatedadministrationoftwopreparations(n=18)