试析荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用

试析荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用

崔志文

浙江双良商达环保有限公司浙江杭州310000

摘要：我们日常生活的环境中存在着较多的微生物群落，通过对其研究可以实现对有害病菌的控制，保证环境质量，降低其对人体的威胁。本文主要对荧光定量PCR技术在环境微生物检测中的应用进行了分析和阐述，以供参考。

关键词：荧光定量PCR技术；环境微生物检测；应用

荧光定量PCR技术作为现今科学技术发展的重要产物，是荧光能量传递技术与PCR仪器的结合体，在现阶段的环境微生物检测中有着非常重要的作用。通过该技术的应用不仅可以对环境中微生物的含量进行实时检测，还可以对其浓度变化曲线进行准确预测，进而为相关工作的开展提供依据。

1.环境微生物的相关内容

1.1概念

环境微生物是存在于自然界中一些极为细小，肉眼无法有效识别的生物体系，其需要利用显微镜等科技设备进行放大后方能了解其构成情况，并具有含量大、结构简单的特征。

1.2环境微生物的种类

环境微生物主要包括病毒、亚病毒、具原核细胞结构的细菌、古菌、真核细胞结构的真菌、原生动物和单细胞藻类这几种。

1.3环境微生物的特征

1）体系小、面积大

这一特征使得环境微生物在影响物质吸收上、废物代谢排泄上以及环境信息交换上有着较为显著的优势。例如100亿个细菌加起来的重量只有1毫克左右；长度在2μm的杆菌，近80个的杆菌的宽度才能达到人类一根头发丝的宽度，要有将近1500个杆菌相互连接才能达到一粒芝麻的大小。

2）结构简单，起源早、进化地位低

结构简单是环境微生物具有的较为明显的特征，不过由于环境微生物种类的不同，其结构组成也会存在着一定差异。如细菌、放线菌以及部分真菌属于单细胞生物；高等真菌则为多细胞生物，具有营养和繁殖器官的区分；病毒和亚病毒是由大分子核蛋白粒子构成的，不具有任何的细胞结构。从历史发展演变情况来看，生物的出现要追溯到38亿年以前，原始海洋出现时，那时的生物主要以水生生物为主，种类较为多样，而在26亿年前，才开始逐渐出现微生物，不过人们对于微生物的发现却只有300年的历史。

3）吸收多、转化快

大肠杆菌在1小时时间内可以分解成自重1000-10000倍的乳糖；产朊假丝酵母的蛋白质合成能力要比大豆高出100倍左右；发酵乳糖细菌在1个小时内可以分解出近1000-10000倍的乳糖，产生乳酸。1千克左右的酵母菌在1天的时间内可以生成数千公斤的糖并发酵成酒精。不过对于一个50千克左右中的成年人来说，让其在一天之内吃掉与体重相等的食物是一件不太可能的事情，据不完全统计计算，要想消耗掉1000-10000倍的食物基本上需要400年左右的时间。

4）生长旺盛、繁殖速度快

将谷氨酸短杆菌摇瓶种子放在50吨左右的发酵罐中，在52天内其细胞数量会增加到原有的32亿倍以上。大肠杆菌在良好的生长环境下可以每12~20分钟左右进行一次分裂，通过这样的数值计算可以得出其在一昼夜的时间内，就可以繁衍72代，如果没有任何因素影响的条件下，细菌细胞在一天之内的繁殖数量可以达到4万亿亿个，2天时间就可以产生将近2.2×1043个后代，由此可以看出，细菌的繁殖量是十分惊人的。

5）变异性和适应能力强

微生物的突变频率一般会在10-5-10-10，加上微生物自身繁殖速度相对较快，数量较多，在与外界接触中，在较短的时间内产生大量的变异后代。例如，青霉素生产菌，在90年代左右，测得每毫升发酵液中青霉素的含量在20单位左右。后随着微生物遗传育种工作者的不断研究和试验，青霉素的变异产量也在不断进行提升，再加上技术的发展实现了发酵条件的优化和创新，现今每毫升发酵水中青霉素的产量可以达到5~10万单位左右。微生物的数量性状变异和育种使产量提高的幅度增大，这是动植物育种工作中绝对不可能达到的；而大肠杆菌中所能容纳的蛋白质分子在20~30万个左右，不过在自身灵活的适应性和代谢调节机制的作用下，其蛋白质分子可以达到100倍的增长，且含有的蛋白质生理功能也会存在很大不同。极端环境的适应能力，如高温、高酸、高盐、高辐射、高压、低温、高碱、高毒等，其变异速率还会逐渐增多。

6）分布广、数量大、种类多

微生物由于其体系小、扩散速度快，分布在环境的各个角落，不管是在深海中，还是在高空下，都有微生物的存在。同时在动物、植物的体内、土壤、矿井等环境下也有会有微生物的存在。微生物的数量是较为庞大的，一般城市街道每立方米的空气范围内就会存在5000个左右的微生物。普通的宿舍环境下，每立方米空气终会含有约2万个微生物。肥沃土壤中的微生物含量相对更多，可以达到每克10034×1012t左右。

微生物物种的种类相对较多、生理代谢类型多、代谢产物多、遗传基因多、生态类型多。现阶段微生物的总数可以达到50~600万中左右，被记载的微生物种类在20万种，原核生物占了3500种、病毒类生物4000种、真菌类生物有9万中，原生动物和藻类可达到10万种。

2.荧光定量PCR技术的概述

PCR是聚合酶链反应的简称，该技术最早出现时，由于其具有较高的灵敏性、特异性和简便易行性的特点被广泛应用于临床医学实验以及生命科学的研究工作中，并取得了较为明显的成就。不过随着科学技术的快速发展，人们已经不能满足于该技术仅在特异的DNA序列等的研究中使用，希望可以向着更加精确的核算定量技术方面发展，基于此，定量PCR技术就成为研究人员们关注的重点内容，希望能够更好的提升基因检测效率的敏感性。直到近几年，荧光定量PCR技术才在原有的PCR技术基础上进行了改良和优化，并更好的提升了原有技能的工作性能和优势。

2.1荧光定量PCR技术的原理及特点

荧光定量PCR技术是将荧光能量传递技术应用在PCR仪器中的一种技术，通过PCR反应以及荧光染料等的加入，实现了对PCR的实时监测效果，并结合最后得出的标准曲线值对位置模板浓度进行定量分析的一种技术。

1）基本原理

荧光定量PCR过程中，一方面对PCR的扩增反应进行了实时监测，另一方面对荧光信号的扩增情况进行了连续分析，并随着时间的不断推移，对荧光信号进行了不断收集与整合，并制定了较为完善的反应变化曲线图。整个PCR反应过程中，荧光的产生主要分为早期、指数期、线性期和平台期这四个阶段，其中早期阶段内，荧光的水平与背景之间有着较为明显的差异。指数期内主要进行的是FQ-PCR可行性定量。

具体的流程为：首先根据PCR反应过程中出现的前15个循环荧光信号作为基本信号来设定荧光信号的域值，且域值设定中的缺省设置要以3~15个循环荧光信号为标准，其中存在的偏差要控制在基本信号的10倍左右。在监测过程中，如果发现域值超过设定的标准范围，则可视为正确信号，并将其作为域值循环数的定义样本。这里的域值循环数指的是反应罐内的荧光信号达到了标准规定的域值循环数。在研究过程中发现，模板中的域值循环数与模板起始时间内所拷贝的对数存在着一定的线性关系，只有当域值循环数高于起始模板的数值导致线性降低时，才可以通过现有的起始拷贝数为基准进行标准曲线的制作。所以需要对域值循环数进行准确掌握，以此来计算起始拷贝数。

2.2化学反应原理

在反应过程中由于荧光物质选择的不同，荧光定量PCR的化学反应原理也会存在差异性，具体包括以下两方面内容：

1）SYBR荧光染料

SYBR荧光染料会双链DNA小沟结合产生一定化学反应。在PCR反应体系中，通过SYBR荧光染料的应用，可以将其与体系中存在的双链DNA进行有效融合，进而发出相应的荧光信号，而其余不掺入链接中的SYBR染料则不会出现任何荧光变化，这样能够更好的保证荧光信号在增加过程中与PCR产物增加的同步性。

2）TAQMAN荧光探针

TAQMAN荧光探针主要以寡核苷酸探针为主。PCR扩增的过程中除了加入引物外还会加入一个特异性的荧光探针，并在探针的两段分别用荧光基团和淬灭基团进行标注。而在探针与靶序列之间进行化学反应后，荧光基团会将淬灭基团所发出的荧光信号进行全部吸收。PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，促使荧光基团和淬灭基团进行分离，进而监测到相应的荧光信号。基本上每扩增一条DNA就会产生一个荧光分子，以此来保证荧光信号积累与PCR产物形成的同步性。

2.3特征

在对PCR产物进行分析时，传统的分析方式一般是以琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光进行观察，或者采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，这几种方式不仅会造成较大的人力和物力消耗，使用的检测材料也存在较大的毒性，对人体健康的危害较高，同时在检测过程中，往往会出现假阳性污染的问题，影响实验效果和质量。但是利用荧光定量PCR技术后，就可以降低上述问题的产生，提高检测的有效性。采用荧光定量PCR技术的优势主要有：

1）灵敏性高。荧光定量PCR技术内包含了光谱和计算机技术，通过这两个技术的联合应用，提高了检测的灵敏度，加强了细节处理效率，保证了检测的质量和效果。2）精准性高。传统的PCR技术由于受到平台效应的影响导致其自身的精确性相对较差，但是荧光定量PCR技术则不会受到扩增效率以及试剂等的影响，只需通过CT数值既可以对初始模板量进行准确计算，有效保证了穗重定量检测结果的准确性。3）特异性。特异性主要体现在荧光探针的应用上，通过与靶序列的调配，促使PCR自动完成了Southern杂交工序。4）安全、快速性。传统的PCR技术在使用中采用的检测材料具有较大的危害性，但是荧光定量PCR技术却是在全封闭状态下实现产物和扩增分析的，不会产生较大的污染源，能够更好的保证人身安全。且同一时间可以对多个样品进行检测，降低了人工作业效率。5）动态性。荧光定量PCR技术可以对PCR反应的全过程进行实时监督和控制，及时掌握检测的情况和效果。且由于系统自身的特性，对于监测人员的要求也相对较低，尤其是在大量样本监测中有着良好的效果。与EROD活性检测法和凝胶阻滞电泳生物监测相比，其具有的特异性更强，放射性的污染更低、灵敏度要更高。

3.荧光定量PCR技术在环境微生物领域中的应用

3.1环境中致病微生物的检测

环境中含有的致病微生物数量相对较多，如果过多聚集在某一处或者产生一定的病变反应，则会带来新的传染性疾病，威胁人们健康，所以对其进行动态性的检测是尤为必要的。在传统致病微生物检测过程中，主要是通过人工培养、细胞培养或者病原体培养并进行显微镜测试的方式来实现的，这就需要投入大量的人力、物力和财力，且容易由于人为操作失误导致最终检测结果出现问题。而采用荧光定量PCR技术后，则可以直接进行取样检测分析工作，省去了中间较为复杂的部分，加之其自身具有特异性、灵敏性和简便性的特点，所以也降低了操作的难度，保证了检测结果的准确性。例如Brooks可以对雨季内海水中含有的甲肝病毒进行及时的检测和定量分析，并能够保证检测结果的精确度，具有较好的发展前景。而Rebecca则可以通过FQ-PCR的应用对水中存在的具有传染性的贾第虫和隐孢子虫进行准确的定量检测，并已经形成较为完善的定量分析系统。

3.2环境微生物群落结构和群落动态研究上的应用

对于环境微生物的研究主要是通过纯培养来实现的，但由于环境微生物中只有一部分可以被培养，所以导致环境微生物群落在分析过程中往往具有一定的局限性。而在分析过程中，采用的主要技术方式有：rRNA分析技术，利用荧光定量PCR技术实现对溶藻菌的含量和分布情况进行检测，如铜绿假单胞菌、交替假单胞菌等，在交替假单胞菌检测中，通过Skovhu加入引物，可以最快速度的检测出细菌DNA在总模板中所占的比例数值，进而推断出其在样本中的含量储备，确保了检测的准确性，有效改善了原有环境微生物群落分析中存在的问题。还有学者采用荧光定量PCR技术对除藻反应器中各种填料介质对太湖水中溶藻细菌之一的假单胞菌属的富集情况进行评价显示，该方法的使用直观准确的将溶藻细菌的富集程度展现了出来，有效定量了假单胞菌在环境样本中的丰度。此外，通过FQ-PCR技术的应用能够对环境微生物群落结构和分布特征进行详细掌握，并对微生物群落的动态变化效果进行完全掌控。Okano等可以通过氨单加氧酶基因的应用来实现土壤中氨氧化细菌群落的检测，并对铵离子浓度对氨氧化细菌群落的影响进行研究。在研究中发现，铵离子浓度的与氨氧化细菌数量的变化呈现正相关，也就是说，铵离子浓度的增加，氨氧化细菌数量也在逐渐增加，但却不会影响细菌总体稳定性，进而保证土壤的肥沃程度。

3.3荧光定量PCR技术应用中存在的问题

在环境微生物检测中，影响荧光定量PCR技术的因素有很多，如寡核苷酸杂交特异性、Taqman探针比例、SYBR浓度大小以及PCR产物的尺寸长短等，这些因素会直接降低定量结果的准确性和科学性。再加上我国目前缺少统一的标准规范，在实验过程中，实验室及人员会根据自身情况制定相应的标准曲线样品，但这就会导致实验结果之间的可比性较低，降低了实验结果的准确性和可靠性。

荧光定量PCR技术主要利用特异性DNA的体外扩增来实现检测，一般来说，该技术可以对各种类型的微生物样品进行PCR扩增，同时也正由于这一特性，使得其对于处在休眠状态下的细菌也有着很好的检测效果，但在病原体检测上则很难有效区分细菌的感染能力，容易造成判断失误。

3.4加强应用的有效措施

1）加大技术人才的培养。制定合理的人才培训计划，保证荧光定量PCR技术使用的标准性、规范性，同时加大资金扶持力度，鼓励更多人员参与到该技术的学习中来。另外，可以通过知识讲座、专业培训等活动的开展来提升技术人员的总体素质，进而为荧光定量PCR技术的落实和应用奠定基础。

2）通过实践案例的剖析，实践演练活动的开展，提高技术人员的整体素质，实现经验的有效积累，提高问题的解决效率，提高环境微生物的研究水平。

3）加大信息技术的应用效率。将信息技术运用在荧光定量PCR技术中将是未来发展的主流趋势，通过信息技术的应用可以在原有技术水平的基础上，提高环境微生物检测工作的效率和水平，提高自动化信号处理的力度，保证检测结果的准确性。同时也能降低人力、物力方面的损耗，减少失误等问题的产生。

4.结束语

荧光定量PCR技术在环境微生物检测和研究中具有较大的发展空间和发展前景，相关工作人员应加大对其重视力度，拓展其应用效率。同时还应在现有技术基础上，对荧光定量PCR技术进行不断的创新和优化，从而实现该技术的进一步发展，提高其应用范围，保证环境微生物研究的质量和效果。

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