小鼠草酸钙肾结石模型建立的初步探索

小鼠草酸钙肾结石模型建立的初步探索

蒙勇燕1邓耀良2

蒙勇燕1邓耀良2（1广西医科大学研究生学院530021；2广西医科大学一附院泌尿外科530021）

【摘要】目的探索一种简便、成石效果好的小鼠草酸钙肾结石模型。方法采用1%乙二醇自由饮水法增加小鼠尿草酸和/或腹腔注射10%葡萄糖酸钙增加尿钙排出量，比较小鼠24小时尿草酸（Ox）、尿钙（Ca2+）、过氧化氢H2O2、乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛（MDA）含量，观察肾草酸钙结晶形成情况，免疫组化法观察CD68蛋自在肾脏中的表达位置并用灰度值法计算其表达水平，评价小鼠草酸钙肾结石造模效果。结果单独诱导高草酸尿或高钙尿的小鼠肾内氧化应激指标增高和巨噬细胞浸润增多但未见结晶，同时介导高草酸尿和高钙尿的小鼠肾内氧化应激损伤指标增高和巨噬细胞浸润增多且有较多结晶。结论单独诱导高草酸尿和高钙尿不足以使小鼠肾内生成结晶，同时诱导高草酸尿和高钙尿成石效果好，巨噬细胞可能在肾结晶形成和/或清除中起到重要作用。

【关键词】草酸钙肾结石动物模型小鼠

【中图分类号】R692.4【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2012）05-0078-02

泌尿系结石草酸钙大鼠动物模型肾结石是一种常见疾病，其中草酸钙结石居多。因此实验动物草酸钙结石模型是肾结石基础与临床研究的重要方法。目前国内主要通过乙二醇饮水法介导大鼠草酸钙肾结石模型[1]。用小鼠诱导草酸钙肾结石模型比较少见。目前认为，小鼠较之于大鼠肾结石形成有较高的耐受性，草酸钙晶体形成几天后即被清除[2]。因此建立一个成石效果好，且简便，经济的小鼠草酸钙肾结石模型并研究小鼠肾内一些结石相关的指标变化及结晶清除机制，对研究肾结石的形成机制和指导临床治疗有重要的意义。

1材料

1.1试剂与仪器乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）测试盒，南京建成生物工程研究；CD68兔抗小鼠多克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒、DAB显色试剂盒，北京博奥森生物技术有限公司；乙二醇(分析纯，天津市化学试剂一厂)。2550型紫外一可见光分光光度计(日本岛津公司)；病理图像分析仪（德国莱卡公司），离子色谱仪（德国DIONEX公司）；自动生化分析仪（美国雅培公司）；LAMBDABIO20双光束紫外分光光度计（美国PE公司）；7170A自动生化分析仪（日本日立公司）JAl203型电子天平(上海天平仪器厂)。

1.2动物昆明小白鼠40只，雄性，体重18～23g，由广西医科大学实验动物中心提供。

2方法

2.1动物分组及给药方法动物饲养1周后，选体重20-25g昆明小白鼠随机分为4组，每组10只，正常颗粒饲料喂养。造模A组：1％乙二醇饮水；造模B组：1％乙二醇+10％葡萄糖酸钙，ip2mL/kg.d；造模C组：10％葡萄糖酸钙，ip2mL/kg.d造模D组：正常饮水。各组小鼠均在相同的条件下饲养。造模共8周。

2.2观察指标及检测方法实验结束前用代谢笼收集并测24h尿量以及用于检测尿草酸（离子色谱法）、尿钙（自动生化分析）、过氧化氢、乳酸脱氢酶、丙二醇的浓度。脱颈椎处死小鼠，切取小鼠的双肾，观察其外观改变，右肾置10％中性福尔马林中固定，作常规HE石蜡切片和VonKossa染色及免疫组化，左肾精密称重后计算各组大鼠的左肾/体重比值。

2.3统计学分析实验数据以X±S表示，用SPSS16.0统计软件分析。计量资料组间比较用One．WayANOVA方差分析，LSD用于比较组内差别。P<0.05为差异有统计学意义。

3结果

3.1动物存活情况各组至实验结束均无动物死亡。

3.2各组小鼠24h尿草酸、钙离子、左肾/体重比值与D组比较，饮用了乙二醇的A、B组尿草酸排泄量显著增加，但两者之间无显著差异（P>0.05）；而腹腔注射了葡萄糖酸钙的B、C组尿钙排泄量显著增加，但两者间无显著差异（P>0.05）；与D组比较，B组肾脏/体重比值高于D组（P<0.05）。

表1.各实验组客观指标H2O2、MDA、LDH的表达

“#”代表与空白组比较，P<0.05

3.3各组小鼠24h尿乳酸脱氢酶（LDH）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）含量

与D组比较，运用了药物干预的A、B、C3组尿H2O2、LDH浓度显著增加，但三者之间无显著差异（P<0.05）；A、B2组尿液MDA、显著增高（P<0.05）。

表2.各实验组客观指标H2O2、MDA、LDH的表达。

“#”代表与空白组比较，P<0.05

3．4肾组织病理学检查及钙盐染色检查肾脏病理检查结果显示，造模B组大鼠的肾体积均较对照组(D组)稍大，外观灰白，表面触摸粗糙不平。造模B组出现结晶，镜下可见肾皮质近曲小管大量结晶体(HE染色中晶体为浅黄或棕黄色，VonKossa染色中晶体呈黑褐色)，结晶成堆分布相互连接，部分近曲肾小管细胞疏松水肿、远曲小管扩张以及管腔内可见脱落细胞，肾间质血管充血，可见炎细胞。造模A、C组镜下未见结晶体，仅发现肾间质血管充血(见图1)。免疫组化病理切片结果提示CD68主要表达于肾脏间质，与D组比较，运用了药物干预的A、B、C3组CD68灰度值显著降低。

图1肾脏切片HE染色和钙盐染色（×200）A:为空白组肾脏（HE染色）；B、C、D为造模B组的小鼠肾脏（B为HE染色，C、D为VonKossa染色），图B、C、D显示小管内结晶形成，且肾小管损伤，管腔扩大。

图2巨噬细胞抗原CD68在各组小鼠肾脏内的表达（×200）

图3各组小鼠肾脏切片CD68

灰度值比较，“#”代表与空白组比较，P<0.05

4讨论

肾结石患者可出现高钙、高草酸盐、高无机磷、高钠和低枸橼酸尿等，其中钙与草酸盐的排泄量是形成结石的重要因素，而无机磷排出增加可使磷酸盐易在尿中形成结晶，成为微小核心，介导异质成核过程，导致草酸钙结石的形成；本研究中各组模型动物的各项肾损伤指标结果以及病理切片观察结果显示，造模B组小鼠肾结石模型造模成功,A、C组均无结石形成，说明单独增加尿草酸和尿钙浓度不足以在小鼠体内产生结晶，同时增加尿草酸和尿钙浓度可以成功诱导小鼠草酸钙肾结石。肾结石动物模型以及临床肾结石患者肾脏处于氧化应激的现象，而抗氧化治疗可以减轻肾损伤和肾内结晶情况，因此肾内发生氧化应激损伤在肾结石的发病过程中起到重要的作用[3,4]。LDH为细胞内酶成分，是胞浆标志酶，只有在细胞壁受损伤的情况下才释放到细胞外，是细胞受损伤的重要指标之一。H2O2是活性氧簇中最主要的组成成分，其含量的多少可以反映ROS的含量。MDA是细胞脂质过氧化反应水平的重要指标。本研究中造模A、B、C3组尿液中LDH、MDA、H2O2含量均高于空白组，说明结石小鼠肾内发生氧化应激损伤。

小鼠较之于大鼠有较强的肾结石耐受性，有文献报道小鼠肾内草酸钙晶体形成几天后即被清除。这种清除的机制与肾内单核/巨噬细胞的吞噬、转运清除能力有关[2,5]。CD68是单核/巨噬细胞的表面标志。本研究通过免疫组化的方法比较各组的巨噬细胞的表达情况，发现造模A、B、C组的CD68灰度值明显低于空白组，说明巨噬细胞表达高于空白组。表明巨噬细胞可能在肾结石的形成和/或清除过程中起到重要的作用。

乙二醇法是目前复制泌尿系统结石动物模型比较成熟的方法，是草酸的前体，进人体内后转化成羟乙酸，后者既可以在羟乙酸氧化酶的作用下直接转化为草酸，也可以通过乳酸脱氧酶的催化转化成乙醛酸，乙醛酸又可以直接在非酶作用下转化为草酸。而传统用于大鼠草酸钙肾结石造模法的乙二醇饮水法应用于小鼠未取得成功，本文通过同时增加尿钙和尿草酸的方法成功建立小鼠草酸钙肾结石，为以后建立小鼠肾结石模型和研究肾脏清除结晶的机制奠定了基础。

参考文献

[1]赖海标,刘朝晖,吴松,欧秀华,顾向明,王书芹,etal.实验性大鼠肾草酸钙结石造模方法筛选研究.中国实验方剂学杂志.2010;(14):135-8.

[2]OkadaA,YasuiT,HamamotoS,HiroseM,KubotaY,ItohY,etal.Genomewideanalysisofgenesrelatedtokidneystoneformationandeliminationinthecalciumoxalatenephrolithiasismodelmouse:detectionofstone-preventivefactorsandinvolvementofmacrophageactivity.JBMR.2009;24(5):908-24.

[3]黎承杨,邓耀良,孙丙华,关晓峰.牛磺酸对大鼠草酸钙结石肾脏的保护作用.中国病理生理杂志.2009;25(004):738-43.

[4]ZuoJ,KhanA,GlentonPA,KhanSR.EffectofNADPHoxidaseinhibitionontheexpressionofkidneyinjurymoleculeandcalciumoxalatecrystaldepositioninhydroxy-L-proline-inducedhyperoxaluriainthemaleSprague-Dawleyrats.NephrolDialTransplant.2011;26(6):1785-96.

[5].OkadaA,YasuiT,FujiiY,NiimiK,HamamotoS,HiroseM,etal.Renalmacrophagemigrationandcrystalphagocytosisviainflammatory-relatedgeneexpressionduringkidneystoneformationandeliminationinmice:Detectionbyassociationanalysisofstone-relatedgeneexpressionandmicrostructuralobservation.JBoneMinerRes.2010;25(12):2701-11.